組織工程椎間盤構(gòu)建及體內(nèi)生物學(xué)功能初步評價(jià).pdf

1、目的：模擬椎間盤組織結(jié)構(gòu)和功能，構(gòu)建具有生物學(xué)活性的組織工程椎間盤，初步評價(jià)其在體內(nèi)的生物學(xué)功能。
　　方法：⑴取3周齡新西蘭大白兔椎間盤組織，利用Ⅱ型膠原酶消化法分別獲取髓核細(xì)胞和纖維環(huán)細(xì)胞，觀察鑒定第二代(P2)細(xì)胞。⑵利用交聯(lián)反應(yīng)制備的殼聚糖水凝膠作為髓核支架，利用靜電紡絲技術(shù)制備的聚對苯二甲酸-共-丁二酸丁二醇酯[poly(butylenesuccinate-co-terephthalate)，PBST]紡絲薄膜作為內(nèi)纖維

2、環(huán)支架，以實(shí)心的PBST環(huán)作為外纖維環(huán)支架。采用掃描電鏡表征殼聚糖水凝膠和PBST紡絲薄膜的空間結(jié)構(gòu)，測試PBST紡絲薄膜的孔隙率及吸水率。⑶在殼聚糖水凝膠、PBST紡絲薄膜上分別接種髓核細(xì)胞和纖維環(huán)細(xì)胞，培養(yǎng)3W后，HE染色檢測支架的細(xì)胞相容性。⑷以殼聚糖水凝膠作為髓核支架，PBST紡絲薄膜作為內(nèi)纖維環(huán)支架，實(shí)心的PBST環(huán)作為外纖維環(huán)支架，組裝成PBST/殼聚糖水凝膠三相組織工程椎間盤支架，檢測三相組織工程椎間盤支架的力學(xué)性能。⑸將

3、P2代纖維環(huán)細(xì)胞、髓核細(xì)胞分別接種在纖維環(huán)、髓核支架上，再移至裸鼠皮下培養(yǎng);4W后，通過HE、番紅-O、CollagenⅡ免疫組化、Aggrecan免疫熒光染色觀察組織工程椎間盤的形態(tài)結(jié)構(gòu)和Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖的表達(dá)。⑹用上述裸鼠皮下培養(yǎng)的組織工程椎間盤置換3月齡新西蘭大白兔的椎間盤，鋼板固定相鄰椎體。術(shù)后4W行X線、MRI檢測并獲取組織工程椎間盤標(biāo)本，通過HE、番紅-O、CollagenⅡ免疫組化、Aggrecan免疫熒光染色觀察組

4、織工程椎間盤的形態(tài)結(jié)構(gòu)和Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖的表達(dá)。⑺提取裸鼠皮下組織工程椎間盤（裸鼠組）、實(shí)驗(yàn)兔體內(nèi)組織工程椎間盤（實(shí)驗(yàn)兔組）、兔正常椎間盤（對照組）的RNA，體外擴(kuò)增CollagenⅡ、Aggrecan基因，RT-PCR檢測Ⅱ型膠原蛋白及蛋白聚糖的表達(dá)。
　　結(jié)果：①體外培養(yǎng)的P2代纖維環(huán)細(xì)胞、髓核細(xì)胞在形態(tài)上呈長梭形或多邊形，生長速度快。兩種細(xì)胞的番紅-O、CollagenⅡ免疫組化、Aggrecan(蛋白聚糖)免疫熒光染

5、色均呈陽性，表明細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原、蛋白聚糖。②殼聚糖水凝膠呈白色海綿狀，吸水后呈透明膠凍狀，掃描電鏡見支架存在大量孔隙，孔隙之間相互連通。接種髓核細(xì)胞體外培養(yǎng)3W后，HE染色可見細(xì)胞在支架內(nèi)生長良好，細(xì)胞分布均勻。③光鏡下見PBST纖維粗細(xì)均勻，無珠狀體形成;PBST紡絲薄膜呈白色，較疏松，孔隙率為61.83％±7.33％，吸水率為297.34％±57.13％;復(fù)合纖維環(huán)細(xì)胞體外培養(yǎng)3W后的PBST紡絲薄膜HE染色可見纖維環(huán)細(xì)胞在PBS

6、T紡絲薄膜內(nèi)分布均勻，細(xì)胞大量增殖。④組裝的三相組織工程椎間盤支架大小約9×5×2 mm，各相之間連接緊密，無明顯縫隙;壓縮強(qiáng)度為3.10MPa±0.13MPa，彈性模量為22.22 Mpa±0.92Mpa;拉伸強(qiáng)度為3.21MPa±0.18MPa，彈性模量為18.13MPa±1.30MPa。⑤裸鼠皮下構(gòu)建的組織工程椎間盤具有與正常椎間盤相似的結(jié)構(gòu)，各相之間融合良好，種子細(xì)胞在組織工程椎間盤內(nèi)分泌Ⅱ型膠原和蛋白聚糖。⑥X線檢測見鋼板內(nèi)固

7、定位置良好，無斷裂、移位，椎間隙高度正常;MRI檢測見組織工程椎間盤T2相為高信號。⑦術(shù)后4W解剖實(shí)驗(yàn)兔，組織工程椎間盤在椎間隙位置良好，形態(tài)完整，無移位、碎裂;組織工程椎間盤的HE染色見大量細(xì)胞，番紅-O、CollagenⅡ免疫組化、Aggrecan免疫熒光染色陽性，表明組織工程椎間盤含有Ⅱ型膠原和蛋白聚糖。⑧RT-PCR: CollagenⅡ mRNA的表達(dá):對照組高于實(shí)驗(yàn)兔組，P=0.001，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;對照組高于裸鼠組，

8、P=0.000，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Aggrecan mRNA的表達(dá):對照組高于實(shí)驗(yàn)兔組，P=0.000，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;對照組高于裸鼠組，P=0.000，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;裸鼠組高于實(shí)驗(yàn)兔組，P=0.000，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：⑴PBST/殼聚糖三相組織工程椎間盤支架材料符合正常椎間盤的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，具有良好的細(xì)胞相容性、孔隙率、力學(xué)性能和可塑性。⑵在裸鼠皮下構(gòu)建的組織工程椎間盤各相之間融合良好，形態(tài)學(xué)觀察、組織結(jié)