新型促血管化骨組織工程支架材料制備及體內(nèi)外生物學(xué)性能評(píng)價(jià).pdf

1、目的：隨著組織工程技術(shù)的快速發(fā)展，組織工程骨的出現(xiàn)為大段骨缺損修復(fù)帶來(lái)新的希望。然而，血管化問(wèn)題仍是制約組織工程骨應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵因素。支架材料作為骨組織工程的三大要素之一，對(duì)組織工程骨體內(nèi)快速血管化和新骨形成起著重要作用。因此，本研究擬制備新型促血管化支架材料并評(píng)價(jià)其體內(nèi)外生物學(xué)性能。
　　方法：(1)新型促血管化支架材料制備及表征：①首先以可溶性鈣鹽、銅鹽、鋅鹽、磷鹽為原料，采用化學(xué)沉淀法制備缺鈣磷灰石粉體。將粉體制成漿料，以

2、海藻酸鈣為造孔劑，經(jīng)高溫煅燒，得到摻雜銅/鋅離子的雙相磷酸鈣多孔支架。根據(jù)離子摻雜含量不同(Cu/(Cu+Zn+Ca)摩爾比分別為0，0.005，0.02，0.05，Cu/Zn摩爾比1∶1），將得到產(chǎn)物分別定義為P0、P1、P2和P3。采用掃描電鏡(SEM)、X射線衍射儀(XRD)、紅外光譜儀(FTIR)、X射線光電子能譜分析儀(XPS)對(duì)支架形貌、晶相組成及化學(xué)成分進(jìn)行表征，萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測(cè)定其強(qiáng)度，電感耦合等離子光譜發(fā)生儀(ICP)

3、檢測(cè)鈣、銅、鋅離子釋放情況。②通過(guò)乳化法合成載GDF-5蛋白的PLGA微球，真空負(fù)壓法將微球與支架(P2)復(fù)合，獲得載GDF-5的多孔支架(定義為P2/GDF-5)。采用SEM對(duì)微球形貌及其在支架上的分布進(jìn)行觀察;采用BCA蛋白測(cè)定法測(cè)定GDF-5的釋放曲線。(2)新型促血管化支架材料體外生物學(xué)性能評(píng)價(jià)：①將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)和內(nèi)皮細(xì)胞(EC)1∶1混合后與支架共培養(yǎng)，SEM和細(xì)胞核熒光染色（DAPI）觀察細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)情況

4、，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，堿性磷酸酶（ALP）試劑盒檢測(cè)ALP活性，熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)水平，ELISA法檢測(cè)VEGF分泌水平;②制備材料浸提液，分別添加等濃度Cu2+、Zn2+的培養(yǎng)基為對(duì)照組，并與細(xì)胞共培養(yǎng)。采用上述方法檢測(cè)細(xì)胞增殖和ALP活性;茜素紅染色觀察BMSC成骨和礦化;Matrigel測(cè)定EC成血管能力。(3)新型促血管化支架材料體內(nèi)生物學(xué)性能評(píng)價(jià)：首先構(gòu)建兔橈骨15mm缺損模型，實(shí)驗(yàn)分為五組：K組：不

5、植入任何材料;D組：植入P0;S1組：植入P1;S2組：植入P2;S3組：植入P2/GDF-5。術(shù)后4、8、12周行X線影像學(xué)檢查，術(shù)后12周處死后，標(biāo)本包埋、切片后行HE、Masson染色。
　　結(jié)果：(1)新型促血管化支架材料表征：①SEM顯示：支架孔徑約600～800μm，孔隙貫通，且隨著金屬離子含量的增加，支架表面由平滑、點(diǎn)狀顆粒、塊狀顆粒逐漸變化。XRD、FTIR和X射XPS分析顯示：P0、P1和P2主要由HA和β-TC

6、P組成，其中P2組HA/TCP為30/70，而P3主要為β-TCP。抗壓強(qiáng)度測(cè)試表明：隨著離子濃度由0％增加到5％，支架抗壓強(qiáng)度由1.51MPa小幅度降至0.91MPa。離子體外釋放顯示，銅、鋅離子釋放量隨添加量的增加而增加，同時(shí)鈣離子釋放速度也隨之加快。②SEM見(jiàn)GDF-5/PLGA微球呈球形，表面光滑，粒徑主要分布在8-20μm之間;微球均勻分布在支架的孔壁上，無(wú)明顯團(tuán)聚。體外釋放示：?jiǎn)渭兾⑶蚝臀⑶蛟谥Ъ懿牧仙?，兩者GDF-5釋放曲

7、線相似，均實(shí)現(xiàn)平穩(wěn)釋放。(2)新型促血管化支架材料體外生物學(xué)性能評(píng)價(jià)：①支架材料均無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞能較好地粘附、生長(zhǎng)，P2/GDF-5支架上的細(xì)胞最多，P2次之;CCK-8檢測(cè)也顯示：各組細(xì)胞增值良好，且P2/GDF-5組細(xì)胞增值明顯優(yōu)于其余三組(P＜0.01)。ALP檢測(cè)表明第14天時(shí)，P2/GDF-5組ALP表達(dá)水平最高，P2組次之。PCR分析顯示P2/GDF-5組細(xì)胞的ALP、OCN、OPN基因表達(dá)水平較其他各組明顯上調(diào)(P

8、＜0.05);P2組細(xì)胞ALP、OCN、OSX表達(dá)水平較P0組高(P＜0.001)。VEGF分泌量檢測(cè)示：各組間均有差異(P＜0.05)，且P2/GDF-5組分泌水平最高。②浸提液結(jié)果表明：浸提液組中細(xì)胞增殖速度最快，且Zn2+組及浸提液組ALP活性明顯高于Cu2+組和空白組(P＜0.01);Matrigel成血管測(cè)試顯示：Cu2+組和浸提液組內(nèi)皮細(xì)胞12h內(nèi)形成管腔樣結(jié)構(gòu)，而Zn2+組和空白組細(xì)胞呈簇狀分布，未見(jiàn)管腔樣結(jié)構(gòu)形成;培養(yǎng)2

9、1天后茜素紅染色顯示，Zn2+組和浸提液組鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量和面積明顯多于空白組和銅離子組。(3)新型促血管化支架材料體外生物學(xué)性能評(píng)價(jià)：術(shù)后動(dòng)物無(wú)死亡，所有動(dòng)物術(shù)后能正常進(jìn)食及活動(dòng)。術(shù)后4周，X線影像學(xué)顯示：所有組支架材料清晰可見(jiàn)，無(wú)脫落、移位，骨缺損間隙明顯，僅S3組兩端可見(jiàn)少量低密度骨痂與材料連接;術(shù)后8周，支架材料部分降解，且S1、S2和S3組材料降解量大于D組，K組和D組中新生硬化骨封閉髓腔口，斷端間暫無(wú)明顯骨性連接，S1、S2和S

10、3均可見(jiàn)斷端部分骨性連接，骨性連接面積：S3＞S2＞S1;術(shù)后12周，K組斷端仍封閉，D組靠近尺骨側(cè)可見(jiàn)少量骨性連接，S1、S2、S3組骨缺損基本愈合，骨皮質(zhì)連續(xù)，部分髓腔實(shí)現(xiàn)貫通，S3修復(fù)速率明顯優(yōu)于其余各組。Lane-Sandhu X線評(píng)分結(jié)果表明，各時(shí)間點(diǎn)S3組評(píng)分最高，S2次之，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。組織學(xué)檢測(cè)表明所有支架植入部位均未出現(xiàn)明顯炎癥、毒性和免疫排斥反應(yīng)。術(shù)后12周HE及Masson染色顯示S1、S

11、2、S3組均可見(jiàn)大量新生骨形成，S3組髓腔塑性較好，且新生血管數(shù)量明顯多于S1和S2組，D組可見(jiàn)部分類骨樣組織沿孔壁生長(zhǎng)，K組缺損部位為大量纖維樣組織;定量統(tǒng)計(jì)分析顯示：S3組新生骨面積和血管數(shù)量多于各組(P＜0.01)。
　　結(jié)論：以海藻酸鈣為造孔劑，以PLGA微球?yàn)檩d體，成功制備了具有GDF-5緩釋功能的銅/鋅離子共摻雜雙相磷酸鈣多孔支架。該支架具有良好的細(xì)胞相容性、成骨誘導(dǎo)性和促血管化，且能快速修復(fù)大段骨缺損，是一種具有良好