組織因子人—鼠嵌合抗體制備的研究.pdf

1、組織因子(tissue factor，TF)是相對(duì)分子量為47 kD的跨膜糖蛋白，在調(diào)節(jié)凝血功能方面有重要的作用，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)TF參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展、血管生成和腫瘤生長(zhǎng)等非凝血功能。利用TF單克隆抗體的導(dǎo)向性和特異性，抑制TF的活性，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。由于鼠源性抗體藥物對(duì)人類具有免疫原性，其廣泛的臨床應(yīng)用受到極大限制，而采用基因工程技術(shù)對(duì)鼠源性抗體進(jìn)行人源化改造是治療用抗體的重要手段。因此，本文在自行研制的抗人TF鼠源性單克

2、隆抗體的基礎(chǔ)上，利用基因工程抗體技術(shù)，成功構(gòu)建了抗人TF人-鼠嵌合抗體基因的真核共表達(dá)質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，篩選獲得能分泌表達(dá)TF嵌合抗體的CHO穩(wěn)定細(xì)胞株(JJ3)，經(jīng)Protein A親和層析柱純化獲得高純度的抗TF嵌合抗體，體外分析該抗體具有抗凝血活性和對(duì)K562和HL-60癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，為TF抗體治療的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　首先利用RNA提取試劑盒，從分泌TF鼠源性抗體的雜交瘤細(xì)胞(mTA)中提

3、取總RNA，以鼠源性TF單克隆抗體重鏈可變區(qū)(VH)及輕鏈可變區(qū)(VL)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，采用RT-PCR獲得重鏈和輕鏈可變區(qū)目的基因。將目的基因分別與pCN40表達(dá)載體連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pCN40-VL-VH。經(jīng)AgeⅠ、BstBⅠ和HpaⅠ、EcoRⅠ分別對(duì)重組質(zhì)粒酶切鑒定和瓊脂糖凝膠電泳分析，兩條目的基因片段大小約為300 bp，與理論值(321 bp、351 bp)相吻合，測(cè)序分析其序列與目的基因序列一致，表明已成功構(gòu)建

4、了抗人TF人-鼠嵌合抗體重組質(zhì)粒pCN40-VL-VH。
　　其次，以中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO-K1)為宿主細(xì)胞，采用中量無(wú)內(nèi)毒素提取質(zhì)粒試劑盒提取重組質(zhì)粒pCN40-VL-VH，陽(yáng)離子脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，經(jīng)G418硫酸鹽(800μg/mL)篩選，并通過(guò)有限稀釋法克隆化培養(yǎng)，培養(yǎng)上清經(jīng)間接ELISA檢測(cè)。對(duì)篩選的分泌抗體陽(yáng)性細(xì)胞株培養(yǎng)上清經(jīng)間接ELISA、Western blot方法分析，獲得了轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCN40-

5、VL-VH的CHO細(xì)胞株(JJ3)，并能穩(wěn)定地分泌抗人TF人-鼠嵌合抗體。利用rProtein A親和層析柱純化該細(xì)胞培養(yǎng)上清中的抗體，純化后的產(chǎn)品經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量分析抗體產(chǎn)量約為50 mg/L。經(jīng)SDS-PAGE分析:純化嵌合抗體的重鏈和輕鏈的分子量分別約為50 kD和26 kD，純度達(dá)到97％以上。
　　最后，選擇K562、HL-60、LOVO、BEL-7402人腫瘤細(xì)胞株，采用MTT法，體外研究了該純化抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖

6、的影響。結(jié)果表明:在一定濃度范圍內(nèi)，該抗體能夠明顯地抑制K562和HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)，最大抑制率分別為35％和64.9％，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，而對(duì)LOVO和BEL-7402細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響。不同濃度的嵌合抗體與27.4μg/mL的TF溫育1.5h，經(jīng)脂化和凝血酶原時(shí)間測(cè)定，表明隨著嵌合抗體濃度的升高，與對(duì)照組相比，正常人血漿的PT顯著延長(zhǎng)(P＜0.01)。
　　上述結(jié)果表明:本研究構(gòu)建了抗人TF人-鼠嵌合抗體重組質(zhì)粒pCN4