雞毒支原體潛在保護(hù)性抗原三磷酸甘油醛脫氫酶的篩選與鑒定.pdf

1、雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum，MG)，又稱雞毒霉形體或雞敗血支原體，是引起雞慢性呼吸道病的病原菌，也是現(xiàn)代養(yǎng)雞業(yè)最常見的病原之一，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前控制MG感染的主要措施是病原凈化與疫苗接種。常用的疫苗主要有滅活疫苗和弱毒疫苗兩種，滅活疫苗生產(chǎn)成本高，且不能阻止MG垂直傳播;弱毒疫苗免疫力弱，存在毒力返強(qiáng)及感染非目標(biāo)雞群的風(fēng)險，從而制約了這兩種疫苗的使用，因此，亟需研發(fā)更安全高效的MG疫苗

2、。而MG疫苗抗原的篩選是疫苗研發(fā)的關(guān)鍵和出發(fā)點(diǎn)，本研究基于機(jī)體局部特異性抗體在抗MG感染過程中尤為重要的事實(shí)，利用MG-HS感染雞群呼吸道沖洗液中特異性抗體篩選相應(yīng)的MG保護(hù)性抗原，并對候選抗原基因及其重組蛋白進(jìn)行了研究。
　　本研究采用雞毒支原體感染健康雛雞，2w后采集血清和呼吸道沖洗液，分別用三種血清學(xué)方法進(jìn)行抗體檢測。其中，間接ELISA法用以區(qū)分黏膜抗體IgA和血清抗體IgY;血凝抑制試驗(yàn)和代謝抑制試驗(yàn)用以區(qū)分所產(chǎn)生的特異

3、性抗體是否對雞毒支原體的生長繁殖具有抑制作用，再以具有生長抑制作用的感染性抗體，定向篩選雞毒支原體菌體表面的保護(hù)性抗原，取得了如下結(jié)果:
　　1.感染雞呼吸道沖洗液中的IgY、IgA同為黏膜免疫抗體
　　雞毒支原體通過滴鼻途徑感染后，呼吸道沖洗液中產(chǎn)生了高效價的IgA抗體(OD450為1.11±0.06)，血清中則較低(OD450為0.46±0.09);IgY抗體在感染雞的血清和氣管沖洗液中均具有很高的抗體效價（OD450分

4、別為2.47±0.17和0.72±0.08），說明雞毒支原體感染后，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了高效價的特異性血清抗體IgY，IgY不僅存在于血清中，而且也被分泌于黏膜表面，這種被分泌于黏膜面的IgY可能與IgA一起在黏膜免疫中共同發(fā)揮著抗感染作用。
　　2.感染雞血清中的血凝抑制抗體(IgY)無代謝抑制作用
　　將感染組和對照組的血清和呼吸道沖洗液進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，檢測其血凝抑制抗體，結(jié)果表明感染組中血清的平均血凝抑制價為1∶6

5、4，呼吸道沖洗液平均血凝抑制價為1∶2，對照組血清和呼吸道沖洗液均沒有血凝抑制作用。代謝抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，感染雞呼吸道沖洗液的代謝抑制效價為6.63±0.95(log2，n=8)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血清的代謝抑制效價1.75±0.71(log2，n=8)(P＜0.01)。
　　3.感染雞產(chǎn)生的黏膜抗體IgA對雞毒支原體的生長和代謝有抑制作用
　　對感染雞血清、氣管沖洗液用三種血清學(xué)方法進(jìn)行了抗體檢測，結(jié)果可以看出，感染2w后，血凝抑制

6、抗體大量出現(xiàn)于血清中，而氣管沖洗液幾乎檢測不到;代謝抑制抗體僅在氣管沖洗液中檢出，血清中檢測結(jié)果為陰性，這與黏膜抗體IgA大量存在于氣管沖洗液、血清中較低的結(jié)果基本一致;IgY抗體則在血清和沖洗液中均能檢出。這些結(jié)果表明:(1)感染后產(chǎn)生的血清抗體IgY亦可作為黏膜抗體與IgA一起出現(xiàn)于黏膜表面;(2)血清中的高效價的血凝抑制抗體（血凝素抗體）對雞毒支原體的生長代謝無抑制作用;(3)感染雞產(chǎn)生的黏膜抗體IgA對雞毒支原體的生長和代謝有抑

7、制作用，即特異性IgA所對應(yīng)的抗原可能就是雞毒支原體的保護(hù)性抗原。
　　4.三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)可能是雞毒支原體的保護(hù)性抗原
　　以雞毒支原體全菌體為抗原，感染雞的呼吸道沖洗液為一抗，羊抗雞IgA及IgY分別為二抗進(jìn)行Western-blot分析，回收主要顯色條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)相關(guān)分析。結(jié)果表明，感染雞氣管沖洗液中MG特異性抗體相對應(yīng)的抗原成分有2個，一個為3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehy

8、de-3-p dehydrogenase，GAPDH)，大小為37KD，是一種糖代謝相關(guān)酶;另一個為VlhA4.12蛋白，大小為75KD，為血凝素家族中的成員。根據(jù)三種血清學(xué)檢測結(jié)果(表4-3)綜合分析，被篩選到的分子量大小為37KD的三磷酸甘油醛脫氫酶可能就是雞毒支原體的一種保護(hù)性抗原;而VlhA4.12蛋白可能與我們以前報道的pMGA相關(guān)。
　　5.三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)及VlhA4.12蛋白的表達(dá)研究
　　利

9、用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)獲得候選抗原基因，并對其中編碼色氨酸的TGA進(jìn)行突變后進(jìn)行原核表達(dá)，并對表達(dá)產(chǎn)物活性進(jìn)行鑒定。結(jié)果成功突變GAPDH和VlhA4.12基因中色氨酸編碼子TGA，并進(jìn)行了原核表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物均能與MG感染雞的呼吸道沖洗液發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)。但重組蛋白GAPDH(rGAPDH)免疫小鼠制備的免疫血清對MG沒有生長/代謝抑制作用。
　　上述結(jié)果為進(jìn)一步進(jìn)行MG黏膜免疫機(jī)制研究拓展了新的思路，為MG免疫預(yù)防及亞單位疫苗的研發(fā)