油脂合成過程中甘油三磷酸脫氫酶基因及乙酰輔酶A羧化酶基因的克隆與鑒定.pdf

1、脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物是人類營養(yǎng)三大要素。如果在食物中長期缺乏脂肪，將引起嚴(yán)重的機能混亂并喪失勞動能力。植物油脂是人類在日常生活中取得脂肪的主要來源之一，對人體健康具有重大意義。植物油脂不僅被廣泛用于人類飲食方面，而且是重要的工業(yè)原料，在制皂、橡膠、制革、染織、蠟燭、潤滑油、合成樹脂、化妝品以及醫(yī)藥等工業(yè)，均需要植物油脂作為原料。
　　 植物油脂的儲存形式為三酰甘油(triacylglycerol，TAG)，對人類有著巨大的營

2、養(yǎng)價值和經(jīng)濟意義。世界主要的油料作物包括大豆、棕櫚、油菜和葵花籽等，其年產(chǎn)油量達到1億噸，而且部分油料作物如油菜籽等的產(chǎn)油量更是逐年遞增。這些作物所產(chǎn)的油主要用于食用及化工行業(yè)。而且隨著化石能源的環(huán)境污染和資源日益匱乏，油脂在生物柴油方向的需求量也日益增加。
　　 植物油脂在未來的經(jīng)濟上的重要性及其可再生的優(yōu)勢非常明顯，對未來能源及環(huán)境有著極其深遠的意義。利用有限的土地資源增加植物油脂的產(chǎn)量是我們的目標(biāo)，這可以利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過

3、對油脂合成中關(guān)鍵酶基因的改造和優(yōu)化從來增加油脂產(chǎn)量。研究表明，超表達油脂合成中的關(guān)鍵酶基因，比如甘油三磷酸脫氫酶(Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase，GPDH)，ACCase(乙酰輔酶A羧化酶)等能夠提高植物中的油脂產(chǎn)量。因此我們將從油脂產(chǎn)量較高的馬鈴薯致病疫霉(Phytophthora infestans)和強壯前溝藻(Amphidinium carterae)中克隆這些相關(guān)酶基因，并將其中的甘油三磷

4、酸脫氫酶(Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase，GPDH)基因轉(zhuǎn)入酵母及模式植物擬南芥中，并成功驗證了其功能。結(jié)果如下：
　　 (1)通過對已測序的馬鈴薯致病疫霉基因組的分析得到一個可能具有甘油三磷酸脫氫酶(PinGPDH)活性的基因序列，對其進行了進化樹分析，發(fā)現(xiàn)其同源性和已克隆并驗證功能的其它物種的GPDH有較高的同源性。進化樹分析也證明其進化地位與擬南芥等植物相似，因而同源性也比較高。

5、>　　 (2)在馬鈴薯致病疫霉中同源克隆到了這個甘油三磷酸脫氫酶的cDNA，命名為PinGPDH1。將其轉(zhuǎn)入酵母不具甘油三磷酸脫氫酶活性的突變體△gpd1中，通過抗鹽實驗及其甘油含量測定證明其在酵母中行使了功能，具備甘油三磷酸脫氫酶活性。
　　 (3)將PinGPDH1轉(zhuǎn)入瞬時表達載體pCambia1300GFP中，進行洋蔥表皮瞬時表達。結(jié)果顯示其在植物的胞質(zhì)中表達，因而它是胞質(zhì)內(nèi)表達的基因。
　　 (4)分別構(gòu)建了3

6、5s組成性啟動子和Napin種子特異啟動子的PinGPDH1表達載體，pCambia2300EC-PinGPDH1和pNapin-pinGPDH1。突變體中表達該基因，出現(xiàn)部分表型恢復(fù)，初步證明其可在擬南芥中正確表達。
　　 (5)同樣的方法得到馬鈴薯致病疫霉中的一個可能的ACCase基因，命名為PinACCase1，分析并通過重疊延伸PCR技術(shù)得到大概3Kb的片段，其中包含其典型的ACCase的BC結(jié)構(gòu)域。
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