串聯(lián)親和純化及氨基酸代謝標(biāo)記-改進的串聯(lián)親和純化研究蛋白質(zhì)復(fù)合物及蛋白-蛋白相互作用.pdf

1、很多蛋白質(zhì)功能是通過形成蛋白質(zhì)復(fù)合體及其蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用共同實現(xiàn)的。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用分析是功能基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的重要研究內(nèi)容之一，是了解蛋白功能的途徑之一?，F(xiàn)在研究蛋白-蛋白相互作用的主要的方法是酵母雙雜交，但該方法的主要缺點是其較高的假陽性和假陰性結(jié)果，需要進一步的實驗來驗證分析。因此，本研究聯(lián)合運用分子克隆等分子生物學(xué)技術(shù)與親和純化、氨基酸代謝標(biāo)記(穩(wěn)定同位素標(biāo)記)及質(zhì)譜等分析化學(xué)技術(shù)，主要發(fā)展了蛋白質(zhì)復(fù)合體

2、串聯(lián)親和純化(TAP)方法，以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究的“氨基酸代謝標(biāo)記-串聯(lián)親和純化-質(zhì)譜新技術(shù)(AACT-TAP-MS)”，和基于氨基酸代謝標(biāo)記技術(shù)的免疫共沉淀(AACT-IP)新方法；并在人肝癌細胞系中分別運用發(fā)展的TAP，AACT-TAP-MS方法分離鑒定了14-3-3(epsilon)蛋白復(fù)合體。本文研究內(nèi)容主要集中在以下幾個方面： 1.改進發(fā)展適合于高等哺乳動物細胞的新的TAP系統(tǒng)和技術(shù)分離純化蛋白復(fù)合體。建立蛋

3、白混合物經(jīng)過“Flag-antiFlagM2”和“鈣調(diào)素結(jié)合肽-鈣調(diào)素”兩次不同的親和結(jié)合、TEV酶酶切和SDS洗脫而分離純化蛋白復(fù)合物的新TAP方法，可在生理條件下簡單快速分離得到蛋白質(zhì)復(fù)合物。與Rigaut當(dāng)初在酵母中建立的“ProteinA-IgG”和“CBP-CM”的TAP方法相比，主要是在TAPtag載體中用兩個短的8肽Flag序列取代了ProteinA序列，分子量減小有利于靶蛋白與TAPtag載體更有效融合表達，且通過ant

4、i-Flag抗體來分離復(fù)合物特異性更強，有效減少非特異性蛋白的結(jié)合。 2.將蛋白定量分析的“氨基酸代謝標(biāo)記-質(zhì)譜技術(shù)”(AACT-MS)，與有效分離蛋白復(fù)合物的串聯(lián)親和純化標(biāo)簽(TAPtag)方法有機整合發(fā)展，建立了d3-Leu氨基酸代謝標(biāo)記-串聯(lián)親和純化-質(zhì)譜新技術(shù)(AACT-TAP-MS)進行蛋白復(fù)合物分離純化、蛋白鑒定及繪制蛋白間直接相互物理作用圖譜的一體化新技術(shù)，提高蛋白質(zhì)鑒定和定量分析的靈敏度和準(zhǔn)確性。AACT-TAP

5、-MS新技術(shù)也為建立大規(guī)模、高通量、快速準(zhǔn)確分析研究人類重要功能蛋白質(zhì)連鎖網(wǎng)絡(luò)提供新的技術(shù)體系。 3.選擇人類重大疾病肝癌為研究對象，以人肝癌細胞為靶細胞，運用發(fā)展的AACT-TAP-MS新技術(shù)，從蛋白質(zhì)間的相互作用、協(xié)同發(fā)揮功能的新角度，分離與肝癌發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)的蛋白14-3-3的復(fù)合物，鑒定了14-3-3zeta，14-3-3theta，actin，Bipprotein及HSP70等蛋白與14-3-3ε存在特異性相互作用。

6、本研究可為肝癌的早期診斷、預(yù)后尋找新的侯選蛋白標(biāo)記物提供新方法。 4.發(fā)展了基于氨基酸同位素代謝標(biāo)記技術(shù)的免疫共沉淀新方法來分離蛋白質(zhì)復(fù)合體、分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用。運用建立的AACT結(jié)合co-IP方法，鑒定出了與目的蛋白14-3-3β特異性相互作用的HSP90A，glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，14-3-3tau等蛋白。 總之，本研究工作不僅在蛋白質(zhì)復(fù)合物分離以及與

7、AACT-MS聯(lián)用的方法學(xué)和研究蛋白質(zhì)功能上具有重要的科學(xué)意義，可為哺乳動物細胞中其他蛋白復(fù)合物的TAP法純化，研究蛋白-蛋白相互作用提供新的技術(shù)方法。AACT-TAP-MS可為我國正在開展的“中國人類肝臟蛋白組計劃”及包括中國參與的國際合作項目“人類肝臟蛋白組計劃”中研究內(nèi)容之一—繪制“人類肝臟蛋白質(zhì)相互作用連鎖圖”，建立大規(guī)模、高通量、快速準(zhǔn)確分析研究人類重要功能蛋白質(zhì)連鎖網(wǎng)絡(luò)提供新的技術(shù)體系。本課題的研究思想和方法代表了系統(tǒng)生物學(xué)