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文檔簡介
1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種老年人中常見的以認知障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD隱匿起病,發(fā)病機制至今仍未闡明。近年來,由于自噬障礙導(dǎo)致的AD中蛋白質(zhì)修飾和降解異常成為新的研究熱點。在AD典型病理特征出現(xiàn)之前,患者腦內(nèi)已經(jīng)有大量的自噬體存在,提示自噬可能是AD患者腦內(nèi)的早期病理反應(yīng)。本研究旨在篩選和建立穩(wěn)定表達自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associat
2、ed protein1 light chain3,LC3)的細胞系,并用于研究Aβ調(diào)控細胞自噬通量(autophagy flux)的效果,及其對細胞生長的作用和可能的機制。
方法:(1)構(gòu)建穩(wěn)定表達EGFP-LC3的HEK293細胞系。本文通過比較細胞轉(zhuǎn)染效率和LC3蛋白表達水平,從6種細胞中篩選用于建系的細胞種類。摸索并確定遺傳霉素(geneticin,G418)的濃度,轉(zhuǎn)染EGFP-LC3表達質(zhì)粒,對細胞進行壓力選擇性篩選
3、。(2)建立Aβ誘導(dǎo)自噬的細胞模型。通過熒光顯微鏡觀察,明確細胞內(nèi)Aβ過量表達以及細胞外Aβ多肽處理這兩種途徑誘導(dǎo)EGFP-LC3-HEK293穩(wěn)定細胞自噬的效果,并進一步探討劑量、時間以及Aβ聚集狀態(tài)與自噬的關(guān)系。用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)確認自噬體的細胞超微結(jié)構(gòu)特征。(3)Aβ誘導(dǎo)細胞自噬的初步機制。以10μmol/L的Aβ40、Aβ42全長肽以及疏水性氨基酸含量不同
4、的4種Aβ截短形式(Aβ1-11、Aβ12-24、Aβ25-35和Aβ35-42)分別處理EGFP-LC3穩(wěn)定細胞24 h,用熒光顯微鏡觀察并計數(shù)LC3的熒光斑點數(shù);用Western blot檢測LC3BⅡ/LC3BⅠ、p62、HSP70及HSP90表達量的變化;用MTT檢測特定Aβ誘導(dǎo)細胞自噬過程中伴隨的細胞活力的改變情況。
結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達EGFP-LC3的細胞系。用700μg/mL的G418加壓篩選6周,獲
5、得EGFP-LC3陽性率為100%的穩(wěn)定細胞系EGFP-LC3-HEK293。(2)成功建立Aβ誘導(dǎo)自噬的細胞模型。細胞內(nèi)Aβ過量表達以及細胞外Aβ多肽處理這兩種途徑均可以誘導(dǎo)細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的LC3熒光斑點,并且具有劑量依賴性、時間依賴性以及二級結(jié)構(gòu)依賴性。確定后續(xù)實驗選用的條件為:聚合24 h的Aβ寡聚體以10μmol/L的濃度處理細胞24 h。在細胞超微結(jié)構(gòu)水平,TEM證實了Aβ可以誘導(dǎo)自噬體的出現(xiàn)。(3) Aβ誘導(dǎo)自噬的機制研究。
6、首先,熒光顯微鏡結(jié)果顯示,不同形式Aβ肽均可以誘導(dǎo)細胞自噬激活,并且Aβ25-35、Aβ40和Aβ42誘導(dǎo)細胞內(nèi)LC3熒光斑點的效果更明顯。誘導(dǎo)自噬的效果與疏水性氨基酸含量無關(guān)。其次,Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,Aβ42組及陽性對照組中LC3BⅡ均有所增加,LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值伴隨細胞自噬增強而增加,提示LC3酯化程度的加強。同時,伴隨自噬的激活,p62蛋白的表達量相應(yīng)減少,提示自噬促進其降解。經(jīng)巴弗洛霉素A
7、1(bafilomycin A1,BafA1)阻斷自噬-溶酶體形成的環(huán)節(jié)后,與空白對照組相比,LC3BⅡ表達水平以及LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值(p<0.01)增加更明顯,同時p62的表達水平未見降低。與Aβ42處理組相比,Aβ42+BafA1組中LC3BⅡ表達水平、LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值(p<0.01)以及p62表達水平(p<0.05)明顯增加。同樣,與血清去除組相比,血清去除+Baf A1組中LC3BⅡ表達水平、LC3BⅡ/L
8、C3BⅠ的比值(p<0.05)以及p62表達水平(p<0.01)也明顯增加。在熱休克蛋白應(yīng)激方面,與空白組相比,Aβ42組及血清去除組中HSP90表達量增加,而HSP70表達量減弱。最后,MTT結(jié)果顯示,與Aβ40相比,Aβ42處理后伴隨自噬表現(xiàn)出的細胞毒性更強(p<0.05)。
結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了EGFP-LC3-HEK293穩(wěn)定細胞系,在細胞水平證實了Aβ誘導(dǎo)自噬的效應(yīng)和機制,并證明Aβ誘導(dǎo)自噬與其細胞毒性相關(guān)。為進一
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