分子伴侶自噬(CMA)在乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移中的作用及其機制研究.pdf

1、乳腺癌是僅次于肺癌的嚴重危害婦女健康的主要惡性腫瘤之一,近年其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。全世界每年約有120萬婦女患乳腺癌,盡管隨著包括乳腺鉬靶攝影、術(shù)后系統(tǒng)性輔助化療等診斷及治療措施在臨床上的廣泛應(yīng)用,乳腺癌的生存率有所提高,但其遠期生存率并未得到明顯改善,約40％左右的患者在接受術(shù)后放化療后仍然死于腫瘤的轉(zhuǎn)移,這已成為乳腺癌防治中的一大難題。因此,闡明乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機制,對于尋找乳腺癌新的診治靶點,提高防治水平,延長病人生命具有十分重

2、要的意義。
　　自噬是真核細胞生物中進化保守的對細胞內(nèi)物質(zhì)進行周轉(zhuǎn)的重要過程。目前研究已證實,細胞自噬主要包括大自噬(macroautophagy, MA)、分子伴侶自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)和小自噬(microautophagy)三種形式。新近,CMA在腫瘤增殖轉(zhuǎn)移中所起的重要作用引起了醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。有學(xué)者報道CMA在肺癌、黑色素瘤等中高表達,并且能夠促進肺癌細胞的成瘤和轉(zhuǎn)移作用

3、;另有學(xué)者通過7例乳腺癌病人組織,發(fā)現(xiàn)LAMP2A表達明顯高于癌旁組織,且通過H2O2刺激伴細胞活力檢測實驗,發(fā)現(xiàn)沉默LAMP2A或過表達LAMP2A具有抑制或促進乳腺癌細胞生長的作用,提示CMA可能在乳腺癌發(fā)生發(fā)展起著重要的作用。但目前國內(nèi)外有關(guān)CMA在乳腺癌增殖中的研究尚不深入,尤其是有關(guān)CMA是否與乳腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的研究未見文獻報道。
　　本研究采用慢病毒感染基因沉默、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達、免疫熒光、激光共聚焦、熒光定量PCR、We

4、stern Blot和關(guān)鍵基因敲除等多種實驗方法和技術(shù),通過MTT、克隆形成、Transwell遷移與侵襲、傷口愈合、裸鼠皮下成瘤以及尾靜脈乳腺癌細胞肺轉(zhuǎn)移等多種體內(nèi)外增殖和轉(zhuǎn)移模型,從細胞和動物水平,觀察了 CMA在乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移中的作用及其分子機制。
　　主要研究內(nèi)容和結(jié)果:
　　一、CMA在乳腺癌組織中高表達,且與乳腺癌的分級呈正相關(guān)1.通過免疫組化對乳腺癌組織芯片中70例乳腺癌組織和7例正常乳腺上皮進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)

5、,CMA途徑中的關(guān)鍵限速蛋白 LAMP2A及其主要分子伴侶 HSC70高表達于臨床乳腺癌標本中,且LAMP2A與HSC70的表達與乳腺癌的分級呈正相關(guān)。
　　二、細胞水平上證實CMA促進乳腺癌細胞增殖轉(zhuǎn)移1.通過LAMP2A shRNA慢病毒表達載體感染和LAMP2A過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù),并采用 Western Blot技術(shù)進行驗證,成功構(gòu)建了 LAMP2A高低表達不同的MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌細胞株。

6、>　　2.間接免疫熒光法結(jié)果顯示,下調(diào)MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌細胞株中LAMP2A表達后,其CMA活性明顯降低;反之,應(yīng)用LAMP2A過表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染法上調(diào)MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌細胞株中LAMP2A表達后,其CMA活性則明顯升高。
　　3.7天MTT增殖曲線結(jié)果顯示,下調(diào)MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌細胞株中LAMP2A表達,能顯著降低乳腺癌細胞的增殖能力。

7、r>　　4. H2O2刺激伴細胞活力檢測實驗結(jié)果顯示,在氧應(yīng)激條件下,下調(diào)MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌細胞株中LAMP2A表達,能顯著降低乳腺癌細胞的存活率。
　　5.克隆形成實驗結(jié)果顯示,下調(diào)MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌細胞株中LAMP2A表達,能明顯抑制乳腺癌細胞的克隆形成。
　　6.Transwell遷移與侵襲實驗證實,下調(diào) MDA-MB-231和 MDA-MB-468細胞中LA

8、MP2A表達后,能顯著抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲能力;反之,上調(diào)MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌細胞株中LAMP2A表達,則能顯著增強乳腺癌細胞遷移和侵襲能力。
　　7.傷口愈合實驗結(jié)果顯示,下調(diào)MDA-MB-231中LAMP2A表達,能顯著抑制乳腺癌細胞的遷移能力。
　　三、動物模型上證實CMA促進乳腺癌細胞增殖轉(zhuǎn)移1.將LAMP2A高低表達不同的MDA-MB-231細胞,分別接種于裸鼠行皮下成瘤實驗,瘤體生

9、長曲線結(jié)果顯示,接種LAMP2A敲除的MDA-MB-231細胞能顯著抑制裸鼠乳腺癌細胞皮下成瘤。
　　2.通過裸鼠皮下成瘤實驗,將小鼠肺組織切片并行 HE染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn),接種LAMP2A敲除的MDA-MB-231細胞的裸鼠,其乳腺癌細胞肺轉(zhuǎn)移明顯降低。
　　3.通過尾靜脈乳腺癌細胞肺轉(zhuǎn)移實驗,將 LAMP2A高低表達不同的MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌細胞,分別經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi),通過HE染色觀察小鼠肺

10、轉(zhuǎn)移情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),接種 LAMP2A敲除的MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞的裸鼠,其乳腺癌細胞肺轉(zhuǎn)移明顯降低。
　　四、CMA抑制乳腺癌細胞大自噬1.采用激光共聚焦證實,下調(diào)MDA-MB-231細胞株中LAMP2A表達后,其大自噬標志物RFP-LC3-Ⅱ斑點形成顯著增多;MDA-MB-468細胞中未見明顯變化。
　　2.采用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),下調(diào)MDA-MB-231細胞株中LAMP2A表達后,其大自噬泡形成明

11、顯增多;MDA-MB-468細胞中未見明顯變化。
　　3.采用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),接種LAMP2A敲除的MDA-MB-231細胞的裸鼠,其皮下瘤體組織中大自噬泡形成明顯增多。
　　4.通過 Western Blot技術(shù)證實,將 LAMP2A高低表達不同的 MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞,分別饑餓刺激0h、6h、12h和24h,結(jié)果發(fā)現(xiàn) LAMP2A敲除的MDA-MB-231細胞中LC3Ⅱ表達明顯增強,且與饑餓刺

12、激時間成正相關(guān);在MDA-MB-468細胞中未見LC3Ⅱ表達發(fā)生改變。
　　五、CMA促進乳腺癌細胞增殖轉(zhuǎn)移與其抑制ATG5大自噬信號通路有關(guān)1.以 MDA-MB-231細胞為研究對象,采用qRT-PCR方法對大自噬信號通路關(guān)鍵基因和大自噬相關(guān)基因進行篩查,結(jié)果顯示,LAMP2A敲除的MDA-MB-231細胞中大自噬相關(guān)基因ATG5表達水平明顯上調(diào)。
　　2.通過Western Blot技術(shù)對關(guān)鍵基因蛋白表達水平進行驗證,結(jié)

13、果發(fā)現(xiàn),LAMP2A敲除的MDA-MB-231細胞中,LC3-Ⅱ和ATG5明顯增加;而mTORC1信號通路相關(guān)分子:p-mTOR Ser2448, Rapter,p-P70S6K Thr389和p-4EBP1 Thr37/46未見明顯改變,mTORC2信號通路相關(guān)分子:p-mTOR Ser2481,Rictor和p-Akt Ser473也未見明顯改變。
　　3.通過siRNA技術(shù)敲除ATG5,采用 H2O2刺激伴細胞活力檢測實驗證

14、實,ATG5表達降低后,下調(diào)自噬活性能逆轉(zhuǎn)敲除LAMP2A對乳腺癌細胞增殖的抑制作用。
　　4.通過siRNA技術(shù)敲除 ATG5,通過Transwell遷移和傷口愈合實驗證實 ATG5敲除后能逆轉(zhuǎn)敲除LAMP2A對乳腺癌細胞遷移的抑制作用。
　　5.采用免疫組化和裸鼠皮下成瘤實驗,發(fā)現(xiàn)接種敲除LAMP2A的MDA-MB-231細胞的裸鼠皮下瘤體組織中,LAMP2A和HSC70明顯降低,而大自噬標志蛋白LC3-Ⅱ和自噬相關(guān)基因