富硒酵母對(duì)銅過量導(dǎo)致小鼠肝損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、銅作為機(jī)體一種重要的必需的微量元素，能維護(hù)骨骼、血管和皮膚正常的功能，促進(jìn)骨骼、血管和皮膚膠原生成，參與機(jī)體的各種代謝。由它組成的酶類與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展直接相關(guān)，其中包括糖尿病、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血脂等。目前研究微量元素多數(shù)重視的是鋅、鐵、硒等，而銅經(jīng)常是被忽略的。因此，了解人體銅的營(yíng)養(yǎng)狀況，以及進(jìn)一步了解銅在機(jī)體健康和疾病中的作用顯得非常必要。 鑒于目前對(duì)于銅缺乏研究較多，但銅過量造成的危害以及如何防治等的實(shí)驗(yàn)報(bào)道研

2、究很少。而且急性銅中毒或者銅過量的病例也很常見，如臨床上的Wilson?。ǜ味?fàn)詈俗冃裕┦怯捎诨蛲蛔円疬^量的銅沉積在肝內(nèi)，最終導(dǎo)致肝功能受損的一系列的過程。 微量元素硒在人和動(dòng)物體內(nèi)的吸收、代謝、運(yùn)轉(zhuǎn)、分布等規(guī)律受肝臟制約，硒是GSH-Px的必需組成部分，GSH-Px能催化還原型谷胱苷肽變成氧化型谷胱苷肽，同時(shí)使有毒的過氧化物（ROOH）還原成無害的羥基化合物，并使H2O2分解，因而可以保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的損

3、害和干擾。因此，本文需要探導(dǎo)的是硒能否拮抗過量銅造成機(jī)體的損害。 目的: 過量的銅對(duì)肝臟具有損傷作用，而微量元素硒作為一種有毒金屬的拮抗劑，對(duì)于銅具有拮抗作用。以往有人用亞硒酸鈉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但這種無機(jī)硒的毒副作用大。本實(shí)驗(yàn)選用富硒酵母作為拮抗劑來代替亞硒酸鈉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，是因?yàn)榻湍甘侨祟惱米顝V的微生物，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%以上，還含有豐富的B族維生素和多種礦物質(zhì)，被稱為優(yōu)質(zhì)營(yíng)養(yǎng)之源，并且具有高度的富硒能力及將化學(xué)硒轉(zhuǎn)化

4、為生物硒的能力，大大消除了亞硒酸鈉作為一種化學(xué)硒對(duì)生物體所產(chǎn)生的毒副反應(yīng)和胃腸刺激。以往研究表明，它能夠更高效、更安全地被生物體吸收利用。因此，富硒酵母可以適當(dāng)?shù)淖鳛橐环N保健品添加到我們的日常食物當(dāng)中，以此對(duì)患有此類疾病人群的肝臟起到一定的保護(hù)作用。 基于上述觀點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠銅過量的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃透晃湍皋卓广~過量的實(shí)驗(yàn)研究，以觀察富硒酵母拮抗過量銅引起的肝損傷的效果及其保護(hù)作用的可能機(jī)制。 方法: 試驗(yàn)一：

5、（銅過量的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?shí)驗(yàn)動(dòng)物為昆明小鼠，采用喂以普通全價(jià)顆粒飼料輔以定期定量灌胃不同劑量銅溶液，快速建立銅過量動(dòng)物模型并觀察動(dòng)物體內(nèi)銅水平的高低、肝臟的病理?yè)p傷及其體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平。具體造模方法如下：32只昆明小鼠平均分為4組，第1組為對(duì)照組，每天用灌胃生理鹽水2次，第2、3、4組作為實(shí)驗(yàn)組，分別用不同濃度（12.8、25.6和38.4 mg/ml）的硫酸銅每日灌胃2次，16周后，觀察肝組織中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（S

6、OD）以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）以及血清和肝組織中銅含量，并做肝臟病理以及電鏡檢查。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用LSD法，肝臟中銅和MDA含量數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)方差不齊，以Welch法進(jìn)行近似方差分析，多重比較采用Tamhane's T2法，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、意義。 試驗(yàn)二：（硒拮抗過量銅效果實(shí)驗(yàn)）40只昆明小鼠雌雄各半，平均體重18～22 g。所有小鼠隨機(jī)分成5組，每組8只，A組：每天用生理鹽水灌胃（0.2 ml/次）兩次作為正常對(duì)照組；B、C、D、E組每天均用512 mg/kg bw·d硫酸銅（以銅計(jì)）灌胃，共20 w，作為實(shí)驗(yàn)處理組；第16 w時(shí)，以灌胃方式分別給予B、C、D組小鼠不同劑量的富硒酵母，即B組：富硒酵母高劑量（60 mg/kg bw·d），C組：富硒酵母中劑量組（

8、40 mg/kg bw·d），D組：富硒酵母低劑量組（20 mg/kgbw·d）；E組小鼠用羧甲基纖維素（為配制富硒酵母的溶劑）灌胃，作為處理對(duì)照組。小鼠雌雄分養(yǎng)于塑料不銹鋼籠內(nèi)，室內(nèi)溫度（23±3）℃，自由進(jìn)食，飲去離子水。第20 w末，所有動(dòng)物麻醉后處死。 觀察補(bǔ)硒對(duì)肝臟丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性以及血清和肝組織中銅含量的影響，并進(jìn)行肝臟病理組織學(xué)檢查和肝細(xì)胞凋亡檢

9、測(cè)，同時(shí)測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用LSD法，肝臟中銅含量數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)方差不齊，以Welch法進(jìn)行近似方差分析，多重比較采用Tamhane's T2法，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 試驗(yàn)一： 第一部分：小鼠銅過量模型的建立。 1.銅過量小

10、鼠的一般狀況： 膚色：與對(duì)照組比較，銅過量模型組小鼠在實(shí)驗(yàn)第3周開始出現(xiàn)皮毛粗糙、稀疏，毛色失去光澤，耳、腳爪、尾巴均出現(xiàn)明顯的色澤蒼白，牙齒呈黃褐色，并隨著實(shí)驗(yàn)的時(shí)間延長(zhǎng)上述癥狀更加明顯。 行為改變：隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，銅過量模型組小鼠生長(zhǎng)緩慢，身體消瘦。表現(xiàn)出倦怠，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，怕冷嗜睡蜷縮成團(tuán)，易受驚嚇，飲食明顯減少。 2.各臟器銅含量及血清銅濃度的比較： 銅過量模型組小鼠的各臟器銅含量和血清銅濃

11、度與對(duì)照組比較均有明顯升高（P<0.01），且都隨灌胃時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，但心臟中的銅含量在低劑量組和中劑量組之間比較差異無顯著性，（P>0.05）。各主要臟器中肝臟內(nèi)銅的沉積量最大，心臟最少，沉積情況依次排列如下：肝臟>脾臟>腎臟>肺臟>心臟。 3.血清SOD活性和MDA含量的比較： 銅過量模型組小鼠血清中SOD的活性與對(duì)照組比較明顯降低（P<0.01），并隨著灌胃時(shí)間的延長(zhǎng)有逐漸降低的趨勢(shì)。銅過量模型組小鼠血清中MDA

12、含量與對(duì)照組比較均明顯升高（P<0.01）。 4.各組小鼠肝臟病理組織學(xué)與酶的檢查： 小鼠肝臟病理學(xué)檢查表明過多的銅沉積可以損傷細(xì)胞，使細(xì)胞排列紊亂、邊界不清，發(fā)生水樣變性、壞死等病理改變，且在匯管區(qū)程度較重，正常組小鼠的肝臟肉眼可見光滑細(xì)潤(rùn)，色紅，邊緣銳利，光鏡下HE染色可見細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉輪廓清晰，肝索排列整齊。模型組特別是高劑量組小鼠的肝臟可見色暗紅且增大，質(zhì)地

13、較脆，光鏡下肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞腫脹，空泡樣變性，并出現(xiàn)輕度淤血，細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，并可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，在肝小葉間可見點(diǎn)狀銅顆粒沉積。 與正常對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組肝組織中MDA含量明顯升高（P<0.05），而SOD和GSH-Px活性明顯下降（P<0.05）；血清ALT、AST活性以及血清、肝臟銅含量明顯升高（P<0.05）；病理組織學(xué)檢查可見高劑量銅灌胃組小鼠肝細(xì)胞變性壞死以及少量銅顆粒沉積；電鏡提示肝細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器異常，并可

14、見銅顆粒。 試驗(yàn)二： 第二部分：富硒酵母對(duì)銅過量導(dǎo)致小鼠肝損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究。 1.不同濃度富硒酵母對(duì)小鼠銅過量導(dǎo)致肝臟損傷ALT、AST活性變化情況： 與正常對(duì)照組相比，處理對(duì)照組和補(bǔ)硒組（低、中、高劑量組）小鼠血清ALT、AST含量顯著升高（P<0.05），而低、中劑量組小鼠血清ALT、AST含量顯著低于處理對(duì)照組（P<0.05）。低、高劑量補(bǔ)硒組小鼠血清Cu含量顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05）

15、，但顯著低于處理對(duì)照組（P<0.05）；而中劑量補(bǔ)硒組小鼠血清Cu含量與正常對(duì)照組無顯著差異（P>0.05），但顯著低于處理對(duì)照組（P<0.05）。低、中、高劑量補(bǔ)硒組小鼠肝臟Cu含量均顯著高于正常處理組（P<0.05），而低于對(duì)照處理組（P<0.05），但中劑量補(bǔ)硒組肝銅含量顯著低于高、低補(bǔ)硒組。 2. 肝細(xì)胞凋亡和肝勻漿SOD、MDA、GSH-Px活性。 正常對(duì)照組小鼠肝臟可見少量凋亡細(xì)胞，而處理對(duì)照組有較多凋亡的肝

16、細(xì)胞；給予低、中劑量的富硒酵母后肝細(xì)胞凋亡有所減少，以中劑量組凋亡率減少最顯著（P<0.05）。處理對(duì)照組小鼠肝勻漿SOD和GSH-Px活性顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05），低、中補(bǔ)硒后活性升高，以中劑量補(bǔ)硒組效果最顯著（P<0.05）（表2）。處理對(duì)照組小鼠肝勻漿MDA含量顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05），低、中補(bǔ)硒后MDA含量降低，以中劑量補(bǔ)硒組效果最顯著（P<0.05）。 3. 肝臟病理組織學(xué)檢查。 正常對(duì)照組

17、小鼠肝臟肉眼見光滑細(xì)潤(rùn)，色紅，邊緣銳利，光鏡下HE染色可見細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉輪廓清晰，肝索排列整齊，處理對(duì)照組和高劑量補(bǔ)硒組小鼠肝臟可見色暗紅且增大，質(zhì)地較脆，光鏡下肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞腫脹，空泡樣變性，并出現(xiàn)輕度淤血，細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，在空白組肝小葉間還可見點(diǎn)狀銅顆粒沉積，低、中劑量補(bǔ)硒組小鼠肝臟肉眼見接近正常，鏡下細(xì)胞腫脹和空泡樣變性有所減輕，銅顆粒少見。 過量硫酸銅能導(dǎo)致小鼠