低分子量蘋果多糖的結(jié)腸炎癌變預(yù)防作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　流行病學資料顯示：在惡性腫瘤中,結(jié)/直腸癌的發(fā)病率及病死率均位居前列。過去十年里，盡管各國研究者在結(jié)/直腸癌的治療藥物及治療策略研發(fā)領(lǐng)域中投注大量精力，取得不少進展。但是，結(jié)/直腸癌的病死率仍然居高不下。因此，尋找結(jié)/直腸癌預(yù)防靶點以及預(yù)防藥物，降低其發(fā)病率，十分必要。飲食在結(jié)/直腸癌發(fā)生、發(fā)展中扮演的角色正日益受到關(guān)注。世界衛(wèi)生組織已將不健康飲食列為結(jié)/直腸癌發(fā)生、發(fā)展的危險因素之一，并指出以水果、蔬菜為主的飲食

2、可顯著降低結(jié)/直腸癌發(fā)病風險。研究表明：蘋果，具有其他水果不能比擬的腸道保健功能，其日攝入量與結(jié)直/腸癌的發(fā)病風險呈負相關(guān)。蘋果的抗氧化能力在所有水果中位居第二，所含黃酮，多酚具有良好的抗腫瘤活性。然而，這些抗氧化物質(zhì)主要存在于蘋果皮中，含量不多。蘋果的果肉富含多糖，文獻報道：混濁的蘋果汁可有效抑制實驗性結(jié)腸癌的發(fā)生，而透明的蘋果汁卻無此功效。使得蘋果汁混濁的主要成分之一就是多糖。若從蘋果中提取多糖，并驗證其具有抗結(jié)腸腫瘤活性，無疑會給

3、蘋果在結(jié)/直腸癌預(yù)防中的應(yīng)用、普通人群以及結(jié)腸癌高危人群（如：炎癥性腸病患者）的結(jié)/直腸癌預(yù)防帶來積極影響。植物多糖的作用機制復雜。目前，人們嘗試應(yīng)用高通量篩選手段，例如：基因芯片、蛋白芯片等技術(shù)研究其可能的作用靶點，并獲得一定結(jié)果。另外，由于植物多糖一般含有半乳糖、半乳糖醛酸組分，對半乳糖殘基具有特異識別功能的半乳糖凝集素家族便成為其可能的結(jié)合及調(diào)節(jié)靶點。其中，半乳糖凝集素-3(galectin-3,gal-3)的研究較為透徹，與結(jié)/

4、直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Gal-3參與正常細胞的生長、分化、凋亡，腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展、粘附、侵襲與轉(zhuǎn)移等過程的調(diào)節(jié)。Gal-3不僅參與調(diào)控了炎癥的轉(zhuǎn)歸，被認為是一種促炎因子，而且具有腫瘤預(yù)警作用，它的表達變化與結(jié)/直腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和/或轉(zhuǎn)移相關(guān):同正常結(jié)腸組織細胞相比，結(jié)腸癌組織細胞的細胞質(zhì)中g(shù)al-3表達明顯升高，細胞核內(nèi)的表達顯著降低。結(jié)腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，血清中g(shù)al-3的濃度明顯高于原位結(jié)腸癌患者血清中的濃度，而后者的濃

5、度又顯著高于正常人血清中的濃度。若證明蘋果多糖能夠影響gal-3的表達，干預(yù)gal-3的功能，將為闡明蘋果多糖的作用機制以及證明其成藥可能奠定基礎(chǔ)。
　　實驗方法：
　　本研究以結(jié)腸癌細胞系SW-1116，HT-29，SW-620以及結(jié)腸炎相關(guān)的小鼠結(jié)腸癌模型為基礎(chǔ)，進行低分子量蘋果多糖（分子量：1000-3000）的抗腫瘤活性評價與機制研究。實驗分為三部分：
　　第一部分：結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)腸癌模型建立與低分子量蘋果多糖

6、的結(jié)腸癌預(yù)防作用評價。將雄性五周齡ICR小鼠120只，隨機分為5組：模型組、3個給藥組和對照組(除模型組為40只，其余各組均為20只)。模型組與給藥組小鼠腹腔注射15mg/kg的1,2-二甲肼(DMH)。一周后，飲用2％右旋葡聚糖苷鈉(DSS)蒸餾水溶液一周，間隔兩周后，再次飲用2％DSS蒸餾水溶液一周。對照組小鼠于實驗開始時腹腔注射生理鹽水，隨后不再給予處理。第九周時，在給藥組的小鼠飼料中加入低分子量蘋果多糖，使其含量分別為2.5％，

7、5％與10％。二十周時乙醚麻醉，處死所有小鼠，收集小鼠腸道樣本，用于病理學檢測及Westernblot實驗。
　　第二部分：以免疫熒光及免疫組化的方法觀察癌變小鼠腸道以及結(jié)腸癌病人腸道粘膜半乳糖凝集素-3(gal-3)與toll樣受體-4(TLR-4)的表達情況。篩選出適度表達gal-3與TLR-4的人結(jié)腸癌細胞株SW-620細胞，借助激光共聚焦，免疫沉淀以及RNA干擾等手段檢測低分子量蘋果多糖的可能作用靶點：gal-3與TLR-

8、4之間的關(guān)系。
　　第三部分：以加入0.1mg/mL低分子量蘋果多糖的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)人結(jié)腸癌細胞株HT-29兩天，收集細胞總RNA進行基因芯片檢測，尋找兩倍變化的差異基因，并采用Westenblot手段驗證其翻譯后蛋白水平的變化。實驗結(jié)果
　　1、低分子量蘋果多糖能有效地預(yù)防小鼠結(jié)腸炎癌變。二十周時，肉眼觀察：DMH/DSS處理（模型組）小鼠，腸道可見多個息肉或毛蟲狀新生物。低分子量蘋果多糖治療組（給藥組），除三只小

9、鼠腸道有少量贅生物外，其余腸道均表現(xiàn)為不同程度的紅腫樣炎癥狀態(tài)。H.E.染色顯示：模型組中，90％的小鼠腸道發(fā)生結(jié)腸腺癌和/或結(jié)腸腺瘤。飼料中加入2.5％，5％及10％低分子量蘋果多糖的給藥組，小鼠結(jié)/直腸腫瘤發(fā)生率率依次下降為：25％，15％與5％，且多數(shù)腸道病理表現(xiàn)為淋巴細胞浸潤，粘膜層、粘膜下層增生等急性、慢性炎癥特征性改變。
　　2、小鼠腸道組織免疫熒光以及人類結(jié)腸癌組織芯片表明：gal-3與TLR-4表達于正常以及不同分

10、期的結(jié)腸癌組織細胞膜上；激光共聚焦結(jié)果顯示：gal-3與TLR-4共表達在SW-620的細胞膜上；免疫共沉淀結(jié)果提示：gal-3與TLR-4存在著分子伴侶的關(guān)系；使用RNA干擾手段觀察到：人為下調(diào)gal-3的表達后，TLR-4的表達水平下降；而人為下調(diào)TLR-4的表達，gal-3的水平無明顯變化。這提示：gal-3有可能輔助TLR-4的模式識別過程，低分子量蘋果多糖可能通過影響gal-3進而影響TLR-4的表達及功能。
　　3、安

11、捷倫公司的人類全基因組芯片（含44,000個基因探針）檢測結(jié)果顯示：低分子量蘋果多糖孵育2天后，結(jié)腸癌細胞株HT-29中333個基因發(fā)生顯著變化。其中，30個基因上調(diào)，303個基因下調(diào)。通路分析發(fā)現(xiàn)：低分子量蘋果多糖主要影響了結(jié)腸癌細胞的周期調(diào)節(jié)通路。細胞流式分析提示：低分子量蘋果多糖可劑量依賴性的使HT-29細胞停滯于G0/G1期；細胞與小鼠腸道粘膜的Westernblot檢測證明：該作用為p53非依賴性。
　　結(jié)論：