Hras12V轉(zhuǎn)基因小鼠雌雄差異性肝腫瘤發(fā)生的蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、目的:
　　肝癌的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多步驟協(xié)同的復(fù)雜過(guò)程?，F(xiàn)有研究表明，男性是肝癌發(fā)生的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，但其具體機(jī)制尚不清楚。本研究旨在對(duì)Hras12V轉(zhuǎn)基因小鼠性別差異性肝腫瘤發(fā)生的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，探究肝腫瘤發(fā)生發(fā)展性別依賴(lài)的分子機(jī)制。
　　方法:
　　通過(guò)對(duì)Hras12V原癌基因在肝細(xì)胞中的特異性表達(dá)誘導(dǎo)形成的轉(zhuǎn)基因肝癌小鼠模型進(jìn)行研究，探索性別差異性肝腫瘤發(fā)生發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)的特點(diǎn)。
　　1.對(duì)H-r

2、as12V轉(zhuǎn)基因肝癌小鼠及正常C57BL/6J（10月齡雄性、10月齡雌性、15月齡雌性，各組9只，共計(jì)54只）小鼠進(jìn)行剖檢，觀察和統(tǒng)計(jì)肝臟的病變情況;應(yīng)用HE染色，檢測(cè)小鼠肝組織病理變化情況。
　　2.對(duì)上述病理證實(shí)的正常小鼠肝組織及Hras12V小鼠肝腫瘤組織及腫瘤周?chē)M織（10月齡雄鼠和15月齡雌鼠）進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取。用Western blot方法檢測(cè)磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(p-MEK)、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（p

3、-ERK1/2）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的蛋白水平。
　　3.對(duì)上述病理證實(shí)的正常小鼠肝組織及Hras12V小鼠腫瘤組織及腫瘤周?chē)M織(10月齡雄鼠和15月齡雌鼠，各組3只，共計(jì)12只)進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。用2D-DIGE方法檢測(cè)正常組織、腫瘤周?chē)M織和腫瘤組織中蛋白質(zhì)變化情況。
　　4.在上述檢測(cè)的差異蛋白點(diǎn)中，隨機(jī)選擇180個(gè)差異

4、蛋白點(diǎn)，應(yīng)用MALDI-TOF/TOFMS進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。
　　5.在上述鑒定差異蛋白中，隨機(jī)選擇7個(gè)蛋白(HSP90B1、β-actin、Albumin、APOA1、CALR、FABP5和PRDX6)，應(yīng)用Western blot方法進(jìn)行驗(yàn)證。
　　6.使用DAVID和UniProt工具對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO和KEGG分析。
　　結(jié)果:
　　1.病理檢測(cè)結(jié)果表明:Hras12V誘導(dǎo)的肝癌小鼠模型，在10月齡雄性和1

5、5月齡雌性小鼠中出現(xiàn)了多發(fā)性肝腫瘤，而在10月齡Hras12V雌性轉(zhuǎn)基因小鼠和正常C57BL/6J雌雄小鼠肝組織中均未發(fā)生腫瘤。腫瘤個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，10月齡Hras12V雄性小鼠＜5mm，5-10mm，＞10mm肝腫瘤都顯著多于15月齡Hras12V雌性小鼠，而10月齡雌性小鼠僅有少量＜5mm的小結(jié)節(jié)發(fā)生。
　　2.Western檢測(cè)結(jié)果表明，雌雄小鼠肝腫瘤組織中的p-MEK激活程度無(wú)顯著差異，而p-ERK、p-AKT和p-mT

6、OR激活程度在雌鼠肝腫瘤組織中的激活程度都顯著高于雄鼠，而p-PI3K的激活程度是雄鼠顯著高于雌鼠。
　　3.2D-DIGE檢測(cè)結(jié)果表明，在所有檢測(cè)2D-DIGE膠中發(fā)現(xiàn)2381個(gè)差異蛋白點(diǎn)。腫瘤組織和腫瘤周?chē)M織與正常組織相比，雄鼠的差異蛋白點(diǎn)個(gè)數(shù)顯著高于雌鼠。腫瘤周?chē)M織與正常組織相比，雌鼠的差異蛋白點(diǎn)個(gè)數(shù)顯著高于雄鼠。
　　4.MALDI-TOF/TOF MS鑒定180個(gè)蛋白點(diǎn)，共鑒定到89個(gè)差異蛋白，且差異蛋白個(gè)數(shù)的

7、變化趨勢(shì)與2D-DIGE差異蛋白點(diǎn)個(gè)數(shù)的變化趨勢(shì)一致。
　　5.Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，在雄性小鼠中，7個(gè)差異蛋白與2D-DIGE檢測(cè)趨勢(shì)一致;在雌性小鼠中，6個(gè)差異蛋白與2D-DIGE檢測(cè)趨勢(shì)一致，僅有PRDX6不一致。
　　6.生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，雌鼠差異蛋白多集中在HCC相關(guān)蛋白模式中;雄鼠差異蛋白多集中在RAS相關(guān)蛋白模式中。
　　結(jié)論:
　　1.Hras12V誘導(dǎo)的肝癌小鼠模型，肝腫瘤