昆仙膠囊對MRL-lpr小鼠狼瘡性腎炎代謝組學影響的研究.pdf

1、目的與意義:狼瘡性腎炎(Lupus nephritis,LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)累及腎臟所引起的一種免疫復合物腎炎,臨床上以發(fā)熱、關節(jié)炎、皮疹及腎臟損害癥狀為主要表現(xiàn)。約有40％～75％的SLE患者在患病5年內(nèi)出現(xiàn)臨床腎臟受累表現(xiàn),而腎活檢幾乎100％有腎臟病理改變。LN是SLE患者最嚴重的并發(fā)癥,也是最常見的死亡原因之一,對其進行積極治療和有效地控制病情進展,至關重要。
　　 到目前為止,有關LN的病因和發(fā)病機制尚未完

2、全清楚,但其主要的發(fā)病過程已得到深入研究:高度活化的B淋巴細胞產(chǎn)生自身抗體,與自身抗原形成免疫復合物是致病的主要因素,相應的細胞因子在發(fā)病過程中起輔助作用。近年來,國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),細胞凋亡異常,產(chǎn)生核小體,暴露自身隱蔽抗原,可能是發(fā)病的主要始動環(huán)節(jié)。另外,樹突狀細胞也參與了LN的發(fā)病和發(fā)展。
　　 LN治療的最終目標是防止疾病的復發(fā),保護腎功能,盡可能減少并發(fā)癥,促進患者的康復。對LN的早期診斷、早期藥物治療是緩解癥狀和控制疾病

3、進程的關鍵。現(xiàn)代醫(yī)學認為,LN的治療原則應包括免疫抑制治療和支持治療,免疫抑制治療的強度應根據(jù)臨床表現(xiàn)、血清學檢查結果及腎臟病變的組織學活性確定。支持治療包括嚴格控制高血壓和高脂血癥,及其他防治慢性腎臟病(CKD)的治療手段。雖然西藥能在一定程度上控制疾病的活動和發(fā)展,但許多藥物不良反應明顯,停藥后病情易復發(fā),且價格昂貴,為此我們有必要結合中醫(yī)藥治療LN。
　　 中醫(yī)無系統(tǒng)性紅斑狼瘡病名,但其臨床表現(xiàn)在文獻中有類似描述,如“蝴蝶

4、斑”、“陰陽毒”、“日曬瘡”等,而狼瘡性腎炎則見于“水腫”、“虛損”等病證中。目前,不少醫(yī)家根據(jù)中醫(yī)理論對LN的病因、病機、辨證論治等方面進行了長期而廣泛深入的討論,形成了較完善的理論體系。多數(shù)學者認為,LN起于先天稟賦不足、肝腎陰虛,在情志內(nèi)傷、勞倦過度、六淫侵襲、陽光暴曬等誘發(fā)因素的作用下,導致熱毒內(nèi)盛或瘀血阻絡,內(nèi)侵臟腑而成。在LN病情發(fā)展過程中,無論活動期、緩解期和恢復期,中醫(yī)辨證“腎虛”始終存在。故治療應以補腎固本貫穿始終。在

5、臨床治療上,發(fā)揮中醫(yī)藥多靶點治療疾病的優(yōu)勢,可以提高本病的整體療效。因此,如何利用傳統(tǒng)中醫(yī)藥的特長,對這一難治性疾病進行有效的治療,是研究LN的重要課題之一。
　　 代謝組學是一門在新陳代謝的動態(tài)進程中,系統(tǒng)研究代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律,揭示機體生命活動代謝本質的科學。應用核磁共振(NMR)、液相色譜.質譜(LC-MS)、氣相色譜-質譜(GC-MS)等高通量、高分辨、高靈敏度的現(xiàn)代儀器分析手段,獲得體液中代謝產(chǎn)物的信息。通過代謝組學方

6、法,研究生物體內(nèi)所有代謝產(chǎn)物(主要是低分子量代謝物)在疾病或外源性物質等因素擾動下的動態(tài)變化,可以反映生物體的病理生理變化趨勢,進而揭示其變化的機制。因此,代謝組學對研究疾病的發(fā)病、診斷、藥物治療有著直接意義。
　　 昆仙膠囊是由昆明山海棠、淫羊藿、枸杞子、菟絲子組成,具有溫陽益腎,活血祛風除濕等功效。其主要成分昆明山海棠(THH)是衛(wèi)矛科雷公藤屬藥物,與中藥雷公藤含有多種相同的活性成分,具有抗炎和免疫抑制作用。近20年來,TH

7、H被廣泛應用于治療類風濕關節(jié)炎、纖維組織炎、紅斑狼瘡、慢性腎炎等多種結締組織病及自身免疫性疾病。昆仙膠囊作為一種新型免疫抑制劑,對慢性腎臟病引起的蛋白尿均有較好的療效,并且治療期間無嚴重的肝、腎功能損害或白細胞降低等情況,服用較安全,已在臨床上廣泛應用于狼瘡性腎炎的治療。目前,盡管對昆仙膠囊已經(jīng)有大量的臨床療效報道,但是實驗研究相對滯后。所以,應該加強對昆仙膠囊作用機理的研究,為有效利用其藥效作用和防治、拮抗不良反應做好基礎。
　

8、　 MRL/lpr小鼠是一種先天性免疫缺陷小鼠,是常用的SLE動物模型之一。MRL/lpr小鼠的癥狀與人類紅斑狼瘡相似,包括顯著的血清自身抗體,免疫復合物腎小球腎炎,血管炎等。通過對其研究闡明了人類LN發(fā)病機制中的很多問題,對當前發(fā)展新的診療方法有重要意義。
　　 為了驗證昆仙膠囊對LN的治療作用,為臨床應用提供實驗依據(jù),本實驗采用MRL/lpr小鼠狼瘡腎炎模型,觀察昆仙膠囊對狼瘡腎炎小鼠血清抗體,蛋白尿,免疫器官的影響及小鼠

9、血清的代謝表型改變,并對其作用機理進行初步探討。
　　 方法和內(nèi)容
　　 2.1.研究對象將18只12～14周齡MRL/lpr小鼠隨機分為三組:模型對照組6只；昆仙膠囊組6只；來氟米特組6只。分別給予生理鹽水；昆仙膠囊0.234mg/g/d；來氟米特片0.0026mg/g.d。各組小鼠每天固定時間灌胃,連續(xù)給藥4周。
　　 2.2.一般情況每周記錄小鼠體重并觀察各組小鼠精神狀態(tài)、食量、活動、關節(jié)、毛色等一般情況。

10、
　　 2.3.尿蛋白及血清抗體檢測給藥前后測尿蛋白濃度及血清ANA、抗dsDNA抗體的含量。
　　 2.4.小鼠免疫器官重量測定末次給藥24h后稱體重,放血處死小鼠,摘胸腺、脾臟、稱其濕重,分別計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)(mg/10g)。脾(胸腺)指數(shù)=10×脾(胸腺)重(mg)/體重(g)。
　　 2.5.病理組織檢查小鼠雙腎置于4％中性甲醛溶液中固定,石蠟包埋、切片,作HE染色,進行光鏡檢查。
　　 2.

11、6.代謝組學研究用基于1H-NMR技術的代謝組學方法檢測用藥后各組小鼠血清,觀察昆仙膠囊對小鼠血清中代謝產(chǎn)物的影響,并對相應機制進行探討。
　　 2.7.數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計采用SPSS13.0、MestReNova5.3.1及SIMCA-P12.0.1軟件包對數(shù)據(jù)和圖譜進行分析。
　　 結果
　　 3.1.各組小鼠的一般情況實驗開始前,各組小鼠均毛色光滑,飲食、活動、體重無差別。在實驗過程中,模型對照組小鼠逐漸出現(xiàn)食

12、欲減退,生長緩慢,活動減少,精神萎靡,反應遲鈍等表現(xiàn)。
　　 3.2.尿蛋白及血清抗體檢測
　　 3.2.1.尿蛋白檢測給藥前,三組小鼠尿蛋白濃度無顯著性差異(P>0.05)。給藥4周末,昆仙膠囊組和來氟米特組小鼠尿蛋白濃度與模型對照組比較明顯降低(P<0.05,P<0.01)；并且兩組間比較無顯著性差異(P>0.05)。比較各組小鼠實驗前后尿蛋白濃度發(fā)現(xiàn),兩個治療組小鼠給藥后比給藥前尿蛋白濃度均降低(P<0.05,P<

13、0.05)；而模型對照組實驗前后比較無顯著性差異(P>0.05)。
　　 3.2.2.血清抗體檢測三組小鼠給藥前,血清ANA水平及抗dsDNA抗體水平均無顯著性差異(P>0.05)。給藥后,兩個用藥組與模型對照組比較,血清抗體水平均明顯降低,差異具有顯著性(P<0.01,P<0.01)。與給藥前比,模型對照組ANA水平在給藥4周末無明顯變化(P>0.05),而抗dsDNA抗體水平顯著升高(P<0.01)；昆仙膠囊組與來氟米特組給

14、藥后血清ANA水平均明顯降低,差異具有顯著性(P<0.01,P<0.01),抗dsDNA抗體水平雖比給藥前有所升高,但是顯著低于同時間模型對照組抗體水平(P<0.05)。
　　 3.3.免疫器官重量測定結果昆仙膠囊組胸腺指數(shù)明顯升高,與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但脾指數(shù)與模型對照組相比無顯著差異。來氟米特組脾指數(shù)明顯上調(P<0.05)。
　　 3.4.腎臟病理學檢查光鏡下觀察到模型對照組小鼠腎小球

15、系膜細胞、內(nèi)皮細胞呈輕中度增生,而兩個給藥組小鼠腎臟病變均較模型對照組有所減輕(P<0.01)。
　　 3.5.代謝組學改變兩個給藥組跟模型對照組比較發(fā)現(xiàn),支鏈氨基酸、丙氨酸、糖蛋白、酮體、檸檬酸、肌酸、磷酸膽堿、牛磺酸、葡萄糖等代謝組分發(fā)生改變。
　　 結論
　　 4.1.通過觀察昆仙膠囊對LN模型小鼠免疫學指標及腎臟病理改變的影響,發(fā)現(xiàn)昆仙膠囊可以顯著降低自身抗體及尿蛋白水平；并能調節(jié)免疫器官,控制腎臟病理損

16、害的進展。提示昆仙膠囊能夠控制LN的活動,緩解病情。
　　 4.2.用基于1H-NMR技術的代謝組學方法檢測用藥后各組小鼠血清,研究結果顯示,昆仙膠囊組小鼠血清跟模型對照組比較,支鏈氨基酸、丙氨酸、糖蛋白、檸檬酸、磷酸膽堿、?；撬帷⑵咸烟呛可?；而酮體、肌酸等代謝組分含量則低于模型對照組。推測昆仙膠囊發(fā)揮作用的機制包含以下幾個方面:一、促進機體正常能量代謝以及增強機體抗氧化能力、免疫力；二、穩(wěn)定細胞膜,維持細胞內(nèi)外滲透壓平衡；