胃泌素調節(jié)激素(OXM)在雙歧桿菌中的表達及其轉基因雙歧桿菌對肥胖小鼠食量、體重的影響.pdf

1、目的: 構建oxyntomodulin基因的雙歧桿菌表達載體，并用此表達載體轉化長雙歧桿菌，觀察目的蛋白oxyntomodulin在雙歧桿菌內的表達及其對小鼠攝食量和體重的影響。 方法: 以長雙歧桿菌的基因組DNA為模板擴增復制子和多聚酶基因序列。PCR擴增來源于雙歧桿菌的信號肽基因，保留克隆質粒pBAD-A的氨芐抗性基因和啟動子基因，在多克隆位點Bst1107上插入雙歧桿菌質粒復制子及聚合酶序列（BLP），并用

2、來源于雙歧桿菌的信號肽序列取代原質粒pBAD-A中基因Ⅲ序列。在BpiⅠ和XbaⅠ之間插入報告基因GFP基因序列（GFP）。BpiⅠ和XbaⅠ雙酶切除大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達質粒載體pBADs-GFP中GFP基因序列，酶切產(chǎn)物與OXM目的片段進行連接反應，獲得含OXM目的片段的大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達質粒載體PBBADs-OXM。以電穿孔法將此表達載體PBBADs-OXM轉化B．longum NCC2705，于氨芐陽性MRS培養(yǎng)基中

3、，37℃厭氧培養(yǎng)。做革蘭氏染色，顯微鏡下觀察轉化后B．longumNCC2705形態(tài)。以轉化后B．longum基因組DNA為模板，PCR擴增16s片段。以此雙歧桿菌質粒為模板，擴增OXM片段。以終濃度為0．2%的阿拉伯糖誘導培養(yǎng)PBBADs-OXM轉化的B．longum，于0、12、24、48小時分別留取菌體和菌液。提取菌體中蛋白。ELISA檢測培養(yǎng)上清中OXM，以50ug總蛋白WESTERNBLOT。取斷乳昆明小鼠，隨機取8只小鼠給予

4、正常飲食，其余小鼠給予高脂飲食，構建肥胖小鼠模型。取肥胖小鼠32只，隨機分為模型組，陰性對照組，OXM組，陽性對照組，每組8只小鼠。陰性對照組小鼠給予阿拉伯糖（終濃度0．2%）誘導的B．longum NCC2705菌液0．9ml灌胃，OXM組小鼠，給予阿拉伯糖誘導的PBBADs-OXM轉化B．longum菌液0．9ml灌胃，陽性對照組小鼠，給予賽尼可1g/kg灌胃，計各組小鼠每天食物攝取量，每周稱量體重。30天后處死動物，檢測血漿甘油三

5、酯水平。另取2月齡昆明小鼠36只，隨機分為3組，正常組給與生理鹽水0．9ml灌胃；陰性對照組給與阿拉伯糖誘導后的B．longum NCC2705菌液0．9ml灌胃，OXM組給與阿拉伯糖誘導后的PBBADs-OXM轉化雙歧桿菌菌液0．9ml灌胃；每日下午，3組均給與13C標記的棕櫚酸，六天后，處死動物。酶聯(lián)免疫法檢測小鼠血清中oxyntomodulin和Ghrelin表達濃度。質譜法檢測13C/總碳比，觀察各組小鼠脂肪代謝。 結果

6、: 未攜帶來源于雙歧桿菌質粒的復制子和聚合酶序列BLP的對照質粒pBS-GFP轉化菌不能形成菌落，而攜帶BLP序列的重組質粒有菌落形成，并且此菌落中細菌保留了長型雙歧桿菌的典型形態(tài)。PCR擴增在800bp和100bp處見條帶出現(xiàn)。分別代表16s和OXM基因片段的形成。酶聯(lián)免疫吸附試驗結果顯示Oxyntomodulin在PBBADs-OXM轉化的B．longum NCC2705培養(yǎng)液上清和菌體沉淀中均有表達，且上清的表達水平高于菌

7、體沉淀中的水平。WESTERNBLOTING顯示：轉化雙歧桿菌在0．2%阿拉伯糖誘導后，在4KD-5KD之間可見蛋白表達條帶。酶聯(lián)免疫吸附試驗結果顯示Oxyntomodulin在PBBADs-OXM轉化的B．longum NCC2705培養(yǎng)液上清和菌體沉淀中均有表達，且上清的表達水平高于菌體沉淀中的水平。動物實驗觀察到：經(jīng)過口服阿拉伯糖誘導的pBBADs-OXM轉化雙歧桿菌菌液或賽尼可后，肥胖小鼠的食物攝取量與模型組小鼠比較顯著減少。O

8、XM組小鼠食量達正常小鼠水平。體重比較結果顯示模型組小鼠體重顯著高于正常組（P<0．05），經(jīng)過灌飼阿拉伯糖誘導的pBBADs-OXM轉化雙歧桿菌菌液，肥胖小鼠體重下降，顯著低于模型組。而長雙歧桿菌B．longum NCC2705處理的小鼠其體重下降不顯著，體重與模型組無差異（P>0．05）。血漿甘油三酯檢測結果：正常組血漿血脂：1．957±0．238mmol/L；模型組：5．468±0．759mmol/L；陰性對照組：2．021±0．

9、177 mmol/L； OXM組：1．661±0．137 mmol/L；陽性對照組：1．692±0．486 mmol/L。模型組血漿甘油三酯顯著高于正常組，OXM組甘油三酯水平顯著低于模型組（P<0．05）。ELISA方法檢測顯示小鼠血清中OXM水平分別為：NS組，36．183±3．876pg/mL；陰性對照組，38．233±4．139pg/mL；OXM組，37．044±4．870 pg/mL，無統(tǒng)計學差異（P>0．05）。 各

10、組小鼠血清中Ghrelin均值分別為：NS組，23．680±3．639pg/mL；陰性對照組32．145±1．571pg/mL；OXM組12．277±580pg/mL。OXM組血清中Ghrelin與陰性對照組有統(tǒng)計學差異（P<0．05） 質譜分析各組13C/總碳比比值分別為：NS組：-20．033±0．056；OXM組：-21．191±0．043；陰性對照組：-21．225±0．049。各組之間無差異。 結論: