巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8)對乳腺癌細胞遷移侵襲的影響.pdf

1、目的：
　　細胞表面糖基化的改變是腫瘤的特征之一，糖鏈的改變影響著糖蛋白的生物功能，從而導致細胞與細胞、細胞與基質(zhì)之間相互作用的改變，進而影響腫瘤細胞的粘附、侵襲和轉(zhuǎn)移。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8)是形成核心巖藻糖修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶，在乳腺癌中有異常的表達，但其具體的作用機制尚不清楚。本課題采用RNA干擾技術(shù)，將靶向針對FUT8的shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進乳腺癌細胞，觀察FUT8干擾對乳腺癌細胞增殖、遷移和凋亡的影響，探討FUT8在乳腺癌發(fā)

2、生發(fā)展中的作用機制，為乳腺癌分子靶向治療和診斷提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、聚合酶鏈式反應檢測正常乳腺上皮細胞株MCF-10A及乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231中9種巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶亞型mRNA的表達，篩選在乳腺癌細胞中高表達的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶亞型。
　　2、利用轉(zhuǎn)染試劑Lip2000將構(gòu)建好的人FUT8基因重組真核質(zhì)粒pGPU/GFP/Neo-FUT8及對照載體轉(zhuǎn)入人乳腺癌細胞株MCF-7、M

3、DA-MB-231中，利用G418篩選陽性克隆細胞。
　　3、Quantitative Real-Time PCR及Western Blot方法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中FUT8基因和蛋白的表達鑒定RNA干擾的效果。
　　4、劃痕實驗和Transwell實驗檢測FUT8干擾對細胞遷移能力的影響。
　　5、Quantitative Real-Time PCR及Western Blot方法檢測粘附分子E-cadherin、β-c

4、atenin和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP9基因和蛋白水平表達的變化。
　　6、激光共聚焦技術(shù)檢測β-catenin在細胞核、細胞膜分布的變化。
　　7、CCK8檢測細胞的增殖能力;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，QuantitativeReal-Time PCR檢測細胞抗凋亡蛋白Bcl-2及細胞周期蛋白cyclinD1基因水平的變化;Western Blot檢測細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達的改變，觀察FUT8低表達對乳腺癌

5、細胞株MCF-7、MDA-MB-231凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1、Quantitative Real-Time PCR和Western Blot結(jié)果表明FUT8-shRNA轉(zhuǎn)染組，F(xiàn)UT8基因和蛋白的表達水平均降低。
　　2、劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果顯示FUT8低表達細胞株遷移能力降低。
　　3、E-cadherin在MCF-7中和MDA-MB-231細胞中的表達量均顯著升高，而β-cateni

6、n表達量則變化不大，但E-cadherin/β-catenin表達總量在兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中是升高的;MMP2和MMP9在兩種細胞株中表達量都降低;顯示FUT8低表達后細胞株粘附能力降低。
　　4、免疫熒光結(jié)果顯示FUT8低表達MDA-MB-231細胞株中，β-catenin蛋白表達量沒有明顯變化，但其在細胞核、膜的分布發(fā)生了改變，膜上表達量明顯增加。
　　5、CCK8實驗結(jié)果顯示FUT8低表達細胞株增殖能力降低;流式細胞分析

7、結(jié)果表明FUT8低表組與對照組相比，細胞凋亡無明顯影響;而干擾組Bcl-2及cyclinD1蛋白表達水平均有所下降。
　　結(jié)論：
　　本實驗成功構(gòu)建了FUT8穩(wěn)定轉(zhuǎn)染低表達細胞株MCF-7、MDA-MB-231;劃痕實驗和Transwell實驗表明FUT8的低表達可以抑制乳腺癌細胞的遷移;CCK8結(jié)果顯示FUT8能夠促進腫瘤的增殖，Bcl-2、cyclinD1的檢測結(jié)果表明FUT8對MCF-7細胞株和MDA-MB-231細胞