Decorin-Fusin雙基因修飾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)肝損傷能力的影響.pdf

1、肝損傷后纖維化形成(Fibrosis following liver injury，F(xiàn)FLI)是發(fā)病率日益增加、廣泛威脅著人類健康的世界范圍性疾病。
　　 FFLI的特征有兩方面：一、以特別是I型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增多、降解減少，過(guò)多沉積在肝內(nèi)；二、功能性肝細(xì)胞的相對(duì)體積、絕對(duì)數(shù)量明顯減少，與此同時(shí)，肝星狀細(xì)胞(HSC)激活。
　　 研究證明，在FFLI發(fā)生機(jī)制中，HSC是ECM大量產(chǎn)生的主要細(xì)胞來(lái)源，是

2、FFLI發(fā)生與發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損是HSC激活的始動(dòng)因素；HSC多種刺激中，TGF-β1及其主導(dǎo)的Smads通路處于FFLI中的中心位置。
　　 抗FFLI理想策略應(yīng)包含三部分：(1)阻止肝內(nèi)纖維合成；(2)刺激肝組織內(nèi)再生細(xì)胞的分裂；(3)損傷肝組織結(jié)構(gòu)的重建。
　　 目前，基于對(duì)FFLI分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，基因治療的基本策略一般可以從以下幾方面著手：第一，以TGF-β1等絲裂原為靶位點(diǎn)，抑制HSC的激活從而減少

3、膠原合成；第二，以MMPs及TIMPs為靶位點(diǎn)，促進(jìn)ECM降解；第三，抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)肝細(xì)胞?；蛑委熚墨I(xiàn)總結(jié)分為：(1) HGF為靶向(2)針對(duì)MMPs及其抑制劑TIMPs(3)針對(duì)間質(zhì)炎癥(4) HSC為靶向治療(5)針對(duì)uPA的方法(6)端粒酶方法(7)肝干細(xì)胞為靶向的治療(8)以TGF-β1為靶向的基因治療(9)針對(duì)RNA干擾技術(shù)的途徑。
　　 研究證明，核心蛋白聚糖(DCN)能調(diào)節(jié)膠原合成等，對(duì)防止組織纖維化的發(fā)生起

4、重要作用；DCN能結(jié)合并滅活TGF-β1，調(diào)節(jié)其生物利用度。
　　 Fusin是CXC家族成員之一，與CXCR4的生物學(xué)特性一致。在損傷肝組織中，某些趨化因子及其相應(yīng)受體如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)和CXC趨化受體-4(SDF-1α/CXCR4)間的相互作用對(duì)表達(dá)相應(yīng)趨化因子和受體的外源性細(xì)胞如骨髓衍生間充質(zhì)干細(xì)胞(BMdMSCs)起趨化作用。
　　 BMdMSCs與HSC之間存在雙向相互影響的現(xiàn)象。有證據(jù)顯

5、示，BMdMSCs可以抑制HSC的激活，而激活的HSC需要BMdMSCs橫向分化成新的肝細(xì)胞，從而刺激內(nèi)源性實(shí)質(zhì)細(xì)胞的更新，增強(qiáng)ECM的降解。
　　 如何使BMdMSCs在已具備有損傷肝細(xì)胞更新能力基礎(chǔ)上，使之同時(shí)獲得并發(fā)揮抗纖維合成的能力呢?
　　 也許對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)干預(yù)手段的基因修飾不失為一種好的選擇。
　　 目前，雙基因修飾BMdMSCs的文獻(xiàn)報(bào)道較少，相關(guān)性研究的大部分集中將一個(gè)目的基因和一個(gè)報(bào)告基因

6、如綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞以便追蹤目的基因表達(dá)情況。采用蛋白水解及纖維連接蛋白追蹤法以及轉(zhuǎn)染技術(shù)將DCN及Fusin最終導(dǎo)入BMdMSCs，目前尚未見(jiàn)到同類文獻(xiàn)報(bào)道；聯(lián)合采用DCN及Fusin并通過(guò)分子干預(yù)手段修飾BMdMSCs的方式來(lái)進(jìn)行FFLI聯(lián)合基因治療，目前也尚未見(jiàn)到同類文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)包含兩部分，每部分的研究目的分述如下：
　　 第一部分：Decorin/Fusin雙基因修飾對(duì)BMdMSCs趨化及抗纖維合

7、成能力的體外實(shí)驗(yàn)研究。目的：(1)觀察通過(guò)蛋白水解及纖維連接蛋白追蹤法構(gòu)建攜帶DCN及Fusin的嵌合體融合基因慢病毒表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入BMdMSCs的可行性；(2)觀察修飾BMdMSCs是否能夠同步、穩(wěn)定表達(dá)導(dǎo)入的兩種基因；(3)通過(guò)體外趨化動(dòng)力學(xué)以及Transwell纖維合成實(shí)驗(yàn)，觀察在特定環(huán)境下，修飾BMdMSCs體外趨化動(dòng)力學(xué)以及趨化穿基質(zhì)膠膜后的抗纖維合成能力。
　　 第二部分：茲標(biāo)記Decorin/Fusin雙基因

8、修飾BMdMSCs大鼠損傷肝內(nèi)活體MRI追蹤及功能評(píng)價(jià)。目的：將PLL介導(dǎo)的SPIO茲標(biāo)記雙基因修飾BMdMSCs，標(biāo)記后的細(xì)胞經(jīng)門靜脈植入藥物性FFLI大鼠體內(nèi)。(1)通過(guò)MRI掃描探討茲標(biāo)記后修飾BMdMSCs大鼠肝內(nèi)的分布情況；(2)通過(guò)術(shù)后纖維化量分析間接評(píng)價(jià)修飾BMdMSCs大鼠體內(nèi)后的生物學(xué)特性。
　　 第一部分 Decorin/Fusin雙基因修飾對(duì)BMdMSCs趨化及抗纖維合成能力的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 一

9、、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、BMdMSCs的分離、鑒定；
　　 2、攜帶嵌合體融合基因重組慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建；
　　 3、慢病毒小包裝、病毒滴度測(cè)定及病毒轉(zhuǎn)染BMdMSCs；
　　 4、修飾BMdMSCs后融合基因及其相關(guān)蛋白的檢測(cè)；
　　 5、雙基因修飾BMdMSCs的趨化動(dòng)力學(xué)及趨化、穿膜后增殖變化；
　　 6、Transwell體外纖維合成實(shí)驗(yàn)。
　　 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　

10、　 1、BMdMSCs培養(yǎng)30小時(shí)后，表面抗原CD34、Thy-1、GSTπ均陽(yáng)性表達(dá)。病毒滴度達(dá)1×107cfu/ml；基因轉(zhuǎn)染效率抗性篩選后達(dá)30％。
　　 2、經(jīng)鼠anti-His抗體免疫印跡檢測(cè)、流式細(xì)胞儀Simultest檢測(cè)、RTPCR確定了兩個(gè)目的基因mRNA水平表達(dá)，而且為同步表達(dá)。
　　 3、與空載體組相比較，修飾BMdMSCs自Boyden或Transwell小室趨化動(dòng)力學(xué)因下室不同處理而改變；SD

11、F-1α處理后趨化、穿膜后貼壁活性增加，且呈劑量依賴性(p＜0.05)。
　　 4、Transwell細(xì)菌膠原酶消化法結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)顯示Ⅰ型膠原、α-SMA均明顯表達(dá)，PDGF條件下的表達(dá)更顯著(p＜0.05)。
　　 第二部分磁標(biāo)記decorin/fusin雙基因修飾BMdMSCs大鼠損傷肝內(nèi)活體MRI追蹤及功能評(píng)價(jià)
　　 一、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、復(fù)合多因素肝纖維化模型的制備、術(shù)前標(biāo)本留?。?br>　

12、　 2、體外磁標(biāo)記修飾BMdMSCs的鑒定以及標(biāo)記后的增殖評(píng)價(jià)；
　　 3、實(shí)驗(yàn)分組、術(shù)前后血清、組織學(xué)檢測(cè)及術(shù)后大鼠肝臟MRI掃描；
　　 4、術(shù)后Ⅰ型膠相對(duì)含量和密度檢測(cè)——纖維化量分析。
　　 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、模型成功率約95％、誘導(dǎo)時(shí)間13周、模型穩(wěn)定。術(shù)中死亡率10％；13周后模型大鼠肝組織HE切片：可見(jiàn)小葉周邊破壞嚴(yán)重、廣泛橋架壞死、假小葉分成獨(dú)立的細(xì)胞團(tuán)。
　　 2、Pru

13、ssian blue染色結(jié)果顯示，幾乎每個(gè)標(biāo)記的修飾BMdMSCs胞質(zhì)內(nèi)均有數(shù)量不等的陽(yáng)性藍(lán)染致密顆粒，未標(biāo)記細(xì)胞無(wú)藍(lán)染顆粒、呈陰性。
　　 3、體外茲標(biāo)記修飾BMdMSCs移植大鼠體內(nèi)后，術(shù)后受試大鼠肝組織普魯士藍(lán)染色見(jiàn)聚集、呈陽(yáng)性藍(lán)染的鐵顆粒細(xì)胞。
　　 4、與術(shù)前相比較，茲標(biāo)記雙基因修飾組大鼠肝組織內(nèi)隨著術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)，肝組織HYP含量、Ⅰ型膠原相對(duì)含量逐步降低，說(shuō)明肝組織內(nèi)雙基因修飾BMdMSCs在肝損傷部位的歸巢

14、、生長(zhǎng)及增殖活性持續(xù)存在。
　　 三、結(jié)論
　　 1、本實(shí)驗(yàn)首次成功構(gòu)建攜帶DCN及Fusin的嵌合體融合基因重組慢病毒表達(dá)載體pLTR-CMV-FIB-Fusin-RKRRKR-DCN質(zhì)粒，首次將DCN及Fusin導(dǎo)入BMdMSCs，使修飾BMdMSCs兼有雙重效應(yīng)的生物學(xué)行為。
　　 2、本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，DCN及Fusin雙基因修飾BMdMSCs是可行的；修飾BMdMSCs可穩(wěn)定、同步表達(dá)Fusin及DCN。

15、DCN及Fusin雙基因轉(zhuǎn)染BMdMSC的轉(zhuǎn)染效率為30％，說(shuō)明重組慢病毒與BMdMSCs之間存在良好的相互作用；但所測(cè)定的轉(zhuǎn)染效率和國(guó)際領(lǐng)先研究小組的報(bào)道(有的報(bào)道稱轉(zhuǎn)染效率＞90％)相比較仍有差距。
　　 3、本實(shí)驗(yàn)首次聯(lián)合使用DCN及Fusin并通過(guò)分子干預(yù)手段及轉(zhuǎn)染技術(shù)修飾BMdMSCs。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)usin/Decorin雙基因修飾BMdMSCs既表現(xiàn)有強(qiáng)的趨化能力，也表現(xiàn)有抗纖維合成能力。
　　 4、

16、Transwell纖維合成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同微環(huán)境下，雙基因修飾BMdMSCs有可能發(fā)生結(jié)構(gòu)性適應(yīng)性變化，能夠從一個(gè)穩(wěn)定的趨化因子樣結(jié)構(gòu)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)纖維合成抑制劑樣結(jié)構(gòu)狀態(tài)。
　　 5、PLL介導(dǎo)SPIO磁標(biāo)記Decorin及Fusin雙基因修飾BMdMSCs植入大鼠體內(nèi)后，T2*WI序列MRI掃描追蹤到了其在損傷肝內(nèi)產(chǎn)生的低信號(hào)密度區(qū)。
　　 6、纖維量結(jié)果提示，磁標(biāo)記修飾BMdMSCs植入大鼠體內(nèi)后，對(duì)Ⅰ型、TG