經(jīng)IL-10基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌治療小鼠結(jié)腸炎的實驗研究.pdf

1、本文對經(jīng)IL-10基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌治療小鼠結(jié)腸炎進行了實驗研究。本研究分為兩個部分：
　　 第一部分：IL-10基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌的研究。
　　 目的：利用小鼠白介素-10基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使所轉(zhuǎn)化的細菌表達并分泌IL-10。
　　 方法：根據(jù)mIL-10的基因序列及大腸桿菌載體的多克隆位點，經(jīng)過優(yōu)化修飾mIL-10基因序列，合成新mIL-10編碼基因序列，連接至原核表達載體pET32a+并測序，EcoRⅠ和Hi

2、ndⅢ雙酶切鑒定目的基因片段的大小。用基因工程技術(shù)將含有mIL-10基因序列的pET32a+/mIL-10克隆到原核表達載體Origami B(DE3)，在體外經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，選擇最佳的誘導(dǎo)條件。Western blot對目的蛋白進行鑒定，并探討IL-10對LPS所誘導(dǎo)RAW264.7激活的抑制作用。
　　 結(jié)果：優(yōu)化的mIL-10基因序列在氨基酸翻譯上同源性為100％，重組的原核表達載體OrigamiB(DE3)/pET3

3、2a+mIL-10在體外可以高效表達，最佳的誘導(dǎo)時間為IPTG1mmol誘導(dǎo)3小時表達量最大，細菌培養(yǎng)基中可檢測目的蛋白的表達，濃度為3.96ng/ml。Western blot檢測目的蛋白具有良好的抗原反應(yīng)性，IL-10能夠有效抑制LPS對RAW264.7的激活作用，減少TNF的釋放。
　　 結(jié)論：mIL-10轉(zhuǎn)化大腸桿菌能表達具有生物學(xué)效應(yīng)的IL-10。
　　 第二部分：IL-10基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌對小鼠結(jié)腸炎的治療

4、研究。
　　 目的：研究經(jīng)IL-10基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌對DSS小鼠結(jié)腸炎腸道炎癥的影響，并探討其相關(guān)機制。
　　 方法：將IL-10基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌簡稱為E.coli-IL-10，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌則簡稱為E.coli0：將小鼠隨機分成6組：正常組對照組，DSS組，DSS+E.coli/IL-10組，DSS+E.coli0組，正常鼠+E.coli/IL-10組以及正常鼠+E.coli組。建立小鼠急性DSS結(jié)腸炎模型。自小鼠模

5、型建立第1天開始，DSS+E.coli/IL-10組和正常鼠+E.coli/IL-10分別給予重組IL-10大腸桿菌1×108cfu/天灌胃至實驗結(jié)束，DSS+E.coli和正常鼠+E.coli分別給予空質(zhì)粒大腸桿菌灌胃至實驗結(jié)束，正常對照組以及DSS組給于同等培養(yǎng)基灌胃至實驗結(jié)束。每天觀察各組疾病活動指數(shù)(DAI)，并在實驗結(jié)束后檢測各組小鼠炎癥腸段腫瘤壞死因子(TNF)和髓過氧化物酶(MPO)等的含量，并測定小鼠結(jié)腸核因子(NF)-

6、κB P65表達。
　　 結(jié)果：⑴DAI評分：DSS-E.coli/IL-10組小鼠的DAI評分與DSS組和DSS-E.coli0兩組相比得分明顯較低(P<0.05)，DSS-Ecoli0組與DSS組之間DAI得分無明顯差異(P>0.05)；對照組與正常鼠+Ecoli0、正常鼠+Ecoli/IL-10間3組DAI得分均為0。⑵組織學(xué)評分：DSS-Ecoli/IL-10(6.22±3.30)低于DSS組和DSS-Ecoli0[(1

7、0.54±4.15)和(10.0±3.00)](P<0.05)，后兩者直接得分無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；飲用DSS水各組均高于對照組(0.88±0.31)(P<0.05)。⑶MPO活性：DSS+E.coli/IL-10組(2.35±0.39)明顯低于DSS組和DSS+Ecoli0組[(4.15±0.77)和(3.5±1.23)](P<0.05)，高于其他3組(P>0.05)。⑷組織勻漿TNF含量：DSS組(237.85±47.01)

8、與DSS-Ecoli0(239.81±50.38)組之間無明顯差異(P>0.05)，高于其他4組(P<0.05)；DSS-Ecoli/IL-10組(172.46±66.71)低于DSS組以及DSS-Ecoli0組(P<0.05)，高于對照組(P>0.05)。⑸結(jié)腸粘膜NF-κB表達：DSS-Ecoli/IL-10組小鼠粘膜中NF-κB的活性明顯低于DSS組和DSS-Ecoli0組(P<0.05)，飲用DSS水的3組小鼠的粘膜NF-κB活