DEHP和MEHP神經(jīng)發(fā)育毒性的體外研究.pdf

1、DEHP是塑料工業(yè)最主要的改性添加劑，全球年產(chǎn)量達(dá)300～400萬(wàn)噸，廣泛應(yīng)用于各種塑料產(chǎn)品中。DEHP 僅依靠分子間作用力而不是化學(xué)鍵與塑料主體基質(zhì)結(jié)合，因此可不斷地從塑料制品中游離出來(lái)，通過(guò)各種途徑進(jìn)入人體。DEHP對(duì)人的急性毒性較低，慢性毒性尚不明確，但大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和一些流行病學(xué)研究提示DEHP及其代謝產(chǎn)物MEHP 可對(duì)發(fā)育中及成年個(gè)體的多種組織系統(tǒng)包括肝、生殖系統(tǒng)、腎、肺及心臟等產(chǎn)生廣泛的慢性毒性作用，并具有致畸性、致突變性和

2、致癌性。由于目前的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有充分涵蓋對(duì)受試物的神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)，而處于發(fā)育階段的神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)毒物作用更為敏感，因此本文以PC12細(xì)胞作為神經(jīng)元細(xì)胞模型，以C6細(xì)胞作為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞模型，研究DEHP、MEHP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化過(guò)程的影響，對(duì)DEHP的神經(jīng)發(fā)育毒性作用進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。
　　 第一部分
　　 目的：以未分化PC12細(xì)胞為模型，研究DEHP、MEHP對(duì)其增殖和分化過(guò)程的影響，從而評(píng)價(jià)其對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育毒性。方法：對(duì)未

3、分化型PC12細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；研究受試物的細(xì)胞增殖毒性時(shí)，向各組加入含有不同濃度（0.1～100mg/L）DEHP 或MEHP的培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照及0.1％DMSO的溶劑對(duì)照。對(duì)受試物細(xì)胞增殖毒性的評(píng)價(jià)方法包括：改良MTT 法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響、臺(tái)盼藍(lán)染料排斥法檢測(cè)活細(xì)胞百分比、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期以及流式細(xì)胞術(shù)和ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞DNA 合成水平。研究受試物對(duì)細(xì)胞分化的影響時(shí)，向各組加入含有50ng/mL 鼠2.5S 神

4、經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）及不同濃度（0.1～100mg/L）DEHP 或MEHP的培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照及0.1％DMSO的溶劑對(duì)照。評(píng)價(jià)受試物對(duì)細(xì)胞分化影響的方法包括：鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化并測(cè)定突起細(xì)胞陽(yáng)性比例、分級(jí)分離獲取細(xì)胞膜蛋白和骨架蛋白并分別應(yīng)用BCA 法和Bradford 法測(cè)定其含量、提取PC12細(xì)胞總RNA 并以逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR 測(cè)定細(xì)胞ChAT mRNA、TH mRNA和GAPDH mRNA水平。結(jié)果：在實(shí)驗(yàn)濃

5、度范圍內(nèi)，DEHP、MEHP對(duì)未分化型PC12細(xì)胞均無(wú)細(xì)胞毒性；0.1～100mg/L DEHP對(duì)未分化型PC12細(xì)胞的活力、細(xì)胞周期中各期細(xì)胞比例及細(xì)胞的DNA 合成水平均無(wú)影響；1.6～100mg/L MEHP降低未分化型PC12細(xì)胞的活力,且存在劑量效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）；0.1～100mg/L MEHP 使細(xì)胞周期中S 期細(xì)胞比例降低，G2 期細(xì)胞比例升高，DNA 合成水平下降，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系（P<0.05）。培養(yǎng)液中加入

6、鼠2.5S 神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化時(shí)，1～100mg/L的DEHP和10～100mg/L MEHP 使分化中PC12細(xì)胞的膜蛋白、細(xì)胞骨架蛋白的含量增加，突起細(xì)胞陽(yáng)性比例增加；以GAPDH mRNA為參照，實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的DEHP和MEHP對(duì)ChAT mRNA水平?jīng)]有影響，對(duì)THmRNA水平起下調(diào)作用，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系（P<0.05）。結(jié)論：0.1～100mg/L的DEHP對(duì)未分化型PC12細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響，而低至0.1m

7、g/L的MEHP 即可對(duì)未分化型PC12細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。1～100mg/LDEHP和10～100mg/L MEHP 均可促進(jìn)NGF 誘導(dǎo)的未分化型PC12細(xì)胞向膽堿能交感神經(jīng)樣細(xì)胞分化。
　　 第二部分目的：以C6細(xì)胞為模型，研究DEHP及其代謝物MEHP對(duì)其增殖和分化過(guò)程的影響，從而評(píng)價(jià)其對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育毒性。方法：對(duì)C6細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；研究受試物的細(xì)胞增殖毒性時(shí)，方法同第一部分。研究受試物對(duì)細(xì)胞分化的影響時(shí)，向各組

8、加入含有2mM 丁酸鈉及不同濃度（0.1～100mg/L）DEHP 或MEHP的培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照及0.1％DMSO的溶劑對(duì)照。評(píng)價(jià)受試物對(duì)細(xì)胞分化影響的方法包括：鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化并測(cè)定延展細(xì)胞陽(yáng)性比例、分離獲取細(xì)胞骨架蛋白并以Bradford 法測(cè)定其含量、提取C6細(xì)胞總RNA 并以逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR 測(cè)定細(xì)胞GFAP mRNA和GAPDH mRNA水平。結(jié)果：在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，DEHP、MEHP對(duì)C6細(xì)胞均無(wú)細(xì)胞毒

9、性；0.4mg/LDEHP 可以使細(xì)胞生長(zhǎng)曲線提高但對(duì)細(xì)胞周期和DNA合成水平無(wú)影響；1.6～100mg/L DEHP對(duì)C6細(xì)胞的活力沒(méi)有影響；0.1～100mg/L DEHP對(duì)C6細(xì)胞的DNA 合成水平和細(xì)胞周期中各期細(xì)胞比例均無(wú)影響；1.6～100mg/L MEHP抑制C6細(xì)胞的活性，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）；0.1～100mg/L MEHP 使細(xì)胞周期中S 期細(xì)胞比例降低，G2 期細(xì)胞比例升高，DNA 合成水平下降，且存

10、在劑量效應(yīng)關(guān)系（P<0.05）。培養(yǎng)液中加入丁酸鈉誘導(dǎo)C6細(xì)胞分化時(shí)，1～100mg/L的DEHP和10～100mg/L MEHP 使分化中C6細(xì)胞的細(xì)胞骨架蛋白含量增加，延展細(xì)胞陽(yáng)性比例升高（P<0.05）；以GAPDH mRNA為參照，1～100mg/L的DEHP和MEHP上調(diào)GFAPmRNA水平，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系（P<0.05）。結(jié)論：0.1～100mg/L的DEHP對(duì)C6細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響，而低至0.1mg/L的MEHP 即可