烏司他丁對離體人肺血管內(nèi)皮細胞保護的實驗研究.pdf

1、目的: 通過培養(yǎng)離體人肺血管內(nèi)皮細胞（pulmonary microvascular endothelial cell，PMVECs），研究烏司他丁在不同時間點對嚴重膿毒癥血清刺激離體PMVECs培養(yǎng)基中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-10（interleukin-10 , IL-10)、細胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1, IC

2、AM-1）、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF)濃度的影響；對PMVECs核因子-κB（Nuclear Factor kappa-B, NF-κB）表達的影響；對PMVECs超微結(jié)構(gòu)的影響，探討烏司他丁治療膿毒癥致ALI／ARDS的機制。
　　 方法：
　　 1、離體培養(yǎng)人肺血管內(nèi)皮細胞（PMVECs），隨機平均分為正常培養(yǎng)組（加入10%胎牛血清，N組）、健

3、康血清組（加入10%健康人血清，H組）、患者血清組（加入10%嚴重膿毒癥患者血清，S組）。分別于0、1、2、4、6小時，通過MTT比色法測定吸光度值（optical density，OD），比較三組PMVECs增殖活力的變化；免疫組織化學(xué)法觀察PMVECs NF-κB的表達，測定并比較平均光密度值（average optical density，AOD）；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定并比較TNF-α、IL-10、ICAM-1、VEG

4、F濃度；透射顯微鏡下觀察S組PMVECs亞顯微結(jié)構(gòu)的改變。
　　 2、離體培養(yǎng)人肺血管內(nèi)皮細胞（PMVECs），隨機平均分為正常培養(yǎng)組（加入10%胎牛血清，N組）、健康血清組（加入10%健康人血清，H組）、患者血清組（加入10%嚴重膿毒癥患者血清，S組）、烏司他丁組（根據(jù)培養(yǎng)基中藥物濃度不同，分為3個亞組：U1組：加入100u∕ml烏司他丁+10%嚴重膿毒癥患者血清；U2組：加入500u∕ml烏司他丁+10%嚴重膿毒癥患者血清；

5、U3組：加入1000u∕ml烏司他丁+10%嚴重膿毒癥患者血清），共6組。分別于0、1、2、4、6小時,留取各組細胞培養(yǎng)基，4000轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘后取上清液，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定并比較各組培養(yǎng)基中TNF-α、IL-10、ICAM-1、VEGF濃度；于培養(yǎng)1小時，免疫組織化學(xué)法觀察各組NF-κB表達；測定并比較各組平均光密度值（average optical density，AOD）；透射電鏡觀察6小時各組PMVECs超微

6、結(jié)構(gòu)的改變。
　　 結(jié)果：
　　 1、（1）MTT比色法：三組不同時間點OD值有差異（p=0.042），不同時間點OD值變化趨勢有差異（p=0.005）。與N組及H組相比，S組1h OD值明顯降低（P=0.007；P=0.002），隨時間延長OD值維持在較低水平。（2）NF-κB免疫組化檢測示：S組PMVECs多數(shù)胞核呈明顯陽性表達，且1h AOD值達高峰，后逐漸下降（0.54±0.06，0.52±0.01，0.49±0

7、.00，0.44±0.03）；N組及H組PMVECs胞核未見NF-κB表達。（3）酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)：與N組、H組相比，S組同時間點培養(yǎng)基中TNF-α、IL-10、ICAM-1、VEGF濃度均明顯升高，且均有顯著差異，S組TNF-α均明顯高于同時間點N組，分別為：1h、2h（p＜0.05）；4h、6h（p＜0.01），S組1h、2h、4h、6hIL-10、ICAM-1、VEGF均明顯高于同時間點N組（p＜0.01），S組TNF

8、-α、ICAM-1、VEGF含量隨時間逐漸增加，IL-10含量先增加后呈下降；不同時相N組、H組TNF-α、IL-10、ICAM-1、VEGF含量均無明顯差異（P﹥0.05）。（4）透射電鏡示：N組與H組電鏡下胞膜完整，胞膜外見豐富的微絨毛，胞漿可見大量橫切面呈圓形或橢圓形的Weibel-Palade小體（WPBs)，少量多泡體。S組PMVECs超微結(jié)構(gòu)隨時間呈進行性改變，1h PMVECs胞膜尚完整，微絨毛略減少，WPBs小體略減少，

9、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張；2h PMVECs胞膜不完整，微絨毛及WPBs明顯減少，線粒體空泡性變，核糖體減少，核周隙增寬，細胞間可見囊泡狀改變；4h PMVECs胞膜斷裂，微絨毛及W-P小體消失,核仁靠邊，核異染色質(zhì)呈團塊狀；6h PMVECs細胞核不規(guī)整，細胞核空泡性變。
　　 2、（1）酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)：TNF-α、IL-10、ICAM-1、VEGF在不同培養(yǎng)基不同時相的變化趨勢均有差異（p＜0.01）；不同培養(yǎng)組間均存在差異

10、（p＜0.01）。（2）與N組相比，S組及U組培養(yǎng)基TNF-α濃度均升高，以S組明顯。培養(yǎng)1小時 U2組、U3組培養(yǎng)基TNF-α濃度較同時間點S組低（p＜0.05；p＜0.01）；培養(yǎng)2、4、6小時 U1、U2、U3組培養(yǎng)基TNF-α濃度均較同時間點S組低（p＜0.01）。U2、U3組4小時培養(yǎng)基TNF-α濃度較同時間點U1組低（p＜0.05；p＜0.01）；U3組6小時培養(yǎng)基TNF-α濃度較同時間點U1組低（p＜0.05）。（3）與N

11、組相比，S組培養(yǎng)基IL-10濃度呈升高后下降；U組培養(yǎng)基IL-10濃度呈升高趨勢，以U3組升高明顯。培養(yǎng)4小時 U2、U3組培養(yǎng)基IL-10濃度較S組高（p＜0.01）；培養(yǎng)6小時 U2、U3組培養(yǎng)基IL-10濃度較S組高（p＜0.05；p＜0.01）。U2、U3組4小時培養(yǎng)基IL-10濃度較同時間點U1組高（p＜0.05，p＜0.01）；U3組6小時培養(yǎng)基IL-10濃度較同時間點U1組高（p＜0.01）。（4）與N組相比，S組及U組培

12、養(yǎng)基ICAM-1濃度均升高，以S組升高明顯。培養(yǎng)1、2、4小時 U2組培養(yǎng)基ICAM-1濃度均較同時間點S組低（p＜0.05）,培養(yǎng)6小時 U2組培養(yǎng)基ICAM-1濃度較同時間點S組低（p＜0.01），培養(yǎng)1、2、4、6小時 U3組培養(yǎng)基ICAM-1濃度均較同時間點S組低（p＜0.01）。U2組1、6小時培養(yǎng)基ICAM-1濃度較同時間點U1組均低（p＜0.05），U3組1、2、4、6小時組培養(yǎng)基ICAM-1濃度較同時間點U1組均低（p＜

13、0.01）。(5)與N組相比，S組及U組培養(yǎng)基VEGF濃度均升高，以S組升高明顯。培養(yǎng)1、2、4、6小時 U2、U3組培養(yǎng)基VEGF濃度均較同時間點S組低（p＜0.01）。U2組4、6小時培養(yǎng)基VEGF濃度較同時間點U2組低（p＜0.05；p＜0.01），U3組1、2、4、6小時培養(yǎng)基VEGF濃度較同時間點U1組均低（p＜0.01）。（6）NF-κB免疫組化檢測示：S組PMVECs多數(shù)胞核呈明顯陽性表達；N組及H組PMVECs胞核未見N

14、F-κB表達；U1組PMVECs多數(shù)胞核亦呈陽性表達；與S組比較，U2組陽性細胞數(shù)明顯減少；U3組僅有少數(shù)PMVECs胞核呈陽性表達。S組的AOD值較N組、H組均明顯升高（p＜0.01）。與S組比較，U2、U3組AOD值明顯降低（p＜0.01）；與U1相比，U2、U3組AOD值明顯降低（p＜0.01）。AOD值由小到大依次為N組、H組、U3、U2、U1組、S組。（7）透射電鏡：S組PMVECs胞膜斷裂，微絨毛及W-P小體消失，胞核空泡性

15、變；U1組PMVECs胞膜不完整，微絨毛及W-P小體消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體擴張，核染色質(zhì)邊集；U2組PMVECs胞膜尚完整，微絨毛及W-P小體略減少，核染色較淡；U3組PMVECs胞膜完整，可見大量微絨毛及W-P小體，多泡體增多。
　　 結(jié)論：
　　 1、嚴重膿毒癥血清可抑制體外培養(yǎng)PMVECs增殖活性，引起PMVECs亞顯微結(jié)構(gòu)損傷。
　　 2、烏司他丁可下調(diào)嚴重膿毒癥血清致體外培養(yǎng)PMVECs NF-κB的表達