PKA-CREB信號(hào)通路在電針改善腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶功能中作用機(jī)制的研究.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 電針對(duì)腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的作用及PKA/CREB信號(hào)通路的影響
　　目的：
　　研究電針對(duì)腦缺血大鼠空間學(xué)習(xí)記憶和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation, LTP）的作用，并探討其對(duì)海馬區(qū)蛋白激酶A-環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白信號(hào)通路（PKA/CREB）的影響。
　　方法：
　　50只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham-operat

2、ed control group）、模型組（model group）、電針組（ EA group）、電針+H89組（ EA+H89 group， N-[2-(p-Bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide·2HCl hydrate, H89）和電針+NS組（EA+NS group）。制備雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎（two-vessel occlusion,2VO）模型。電針百會(huì)穴（

3、GV20）和大椎穴（GV14），連續(xù)治療7d。治療結(jié)束后，通過Morris水迷宮（Morris water maze，MWM）檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，在體記錄海馬Schaffer側(cè)支-CA1通路的LTP現(xiàn)象，并通過免疫蛋白印跡法（western blot）檢測(cè)海馬區(qū)磷酸化CREB（phosphoCREB，pCREB）蛋白的表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1．Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延

4、長(zhǎng)（P<0.05）而在目標(biāo)象限的停留時(shí)間顯著減少（P<0.01）；與模型組相比，電針組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05）而在目標(biāo)象限的停留時(shí)間顯著增加（P<0.01）；電針+H89組較電針+NS組的大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P<0.05），而在目標(biāo)象限的停留時(shí)間顯著減少（P<0.01）。
　　2．在體LTP檢測(cè)中：對(duì)HFS刺激后60min時(shí)間段大鼠海馬Schaffer側(cè)支-CA1通路fEPSP波幅相對(duì)斜率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與假手

5、術(shù)組相比，模型組的fEPSP波幅相對(duì)斜率均顯著下降（P<0.01），而電針組較模型組的fEPSP波幅相對(duì)斜率均顯著升高（P<0.01）；電針+H89組的fEPSP波幅相對(duì)斜率較電針+NS組均顯著下降（P<0.01）。
　　3． Western blot實(shí)驗(yàn)中：模型組較假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)的pCREB蛋白量顯著降低（P<0.01），而電針組較模型組大鼠海馬區(qū)的pCREB蛋白量顯著增加（P<0.05）；電針+H89組較電針+NS組大鼠海

6、馬區(qū)的pCREB蛋白量顯著降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．電針百會(huì)穴和大椎穴可改善腦缺血大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能下降和LTP受損。
　　2．腦缺血大鼠海馬區(qū)pCREB蛋白表達(dá)下降，而電針可抑制腦缺血大鼠海馬區(qū)pCREB蛋白表達(dá)量的下降，提示電針的作用可能與影響pCREB蛋白的表達(dá)相關(guān)。
　　3．給予H89阻斷PKA后，電針的上述作用均被抑制，進(jìn)一步驗(yàn)證了電針的作用可能與PKA/CREB信號(hào)通路相關(guān)。

7、r>　　第二部分 電針激活PKA/CREB信號(hào)通路對(duì)腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的作用及機(jī)制研究
　　目的：
　　設(shè)置7d、14d、21d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，研究電針對(duì)腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的作用及對(duì)PKA/CREB信號(hào)通路中凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2的影響。
　　方法：
　　120只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham-operated control group）、模型組（model group）、電針組（EA

8、group）、電針+H89組（EA+H89 group）和電針+NS組（EA+NS group），每組又分為7d、14d、21d三個(gè)亞組。制備雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎（two-vessel occlusion,2VO）模型。電針百會(huì)穴（GV20）和大椎穴（GV14）。在7d、14d、21d后，通過TUNEL法（TdT-mediated dUTP nick end labeling）和免疫蛋白印跡法（western blot）觀測(cè)海馬神經(jīng)元

9、凋亡水平及Bax蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1．TUNEL染色發(fā)現(xiàn)：（1）隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)，模型組14d組、21d組較7d組顯著增加（P<0.05）；電針組在7d、14d、21d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元凋亡率呈逐漸增加趨勢(shì)，但三個(gè)亞組間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；其余各組的三個(gè)亞組間海馬神經(jīng)元凋亡率未見顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。（2）同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠間的海馬神經(jīng)元凋亡率相比，在7d、14d和21d

10、，模型組較假手術(shù)組均顯著增加（P<0.05）；電針組較模型組均顯著降低（P<0.05）；電針+H89組較電針+NS組均顯著增多（P<0.05）。
　　2．Western blot實(shí)驗(yàn)中：（1）隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)，電針組21d組較14d組Bcl-2蛋白量顯著增多（P<0.05）；其余各組的三個(gè)亞組相比，Bax蛋白和Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量未見顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。（2）同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠間的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量相比，在7d、

11、14d和21d，模型組較假手術(shù)組Bax蛋白量均顯著增高（P<0.05），而Bcl-2蛋白量均顯著降低（P<0.05）；電針組較模型組Bax蛋白量均顯著降低（P<0.05），而Bcl-2蛋白量均顯著增加（P<0.05）；電針+H89組較電針+NS組Bax蛋白量均明顯增多（P<0.05），而Bcl-2蛋白量明顯降低（P<0.05），但在14d時(shí)兩組Bcl-2蛋白表達(dá)差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．電針

12、治療7d、14d和21d時(shí)均可顯著減輕腦缺血大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡。
　　2．電針的作用可能與調(diào)控Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表達(dá)相關(guān)。
　　3．給予H89阻斷PKA后，電針的上述作用均被抑制，進(jìn)一步驗(yàn)證了電針可能通過激活PKA/CREB信號(hào)通路發(fā)揮抗神經(jīng)元凋亡的作用。
　　第三部分 電針激活PKA/CREB信號(hào)通路對(duì)腦缺血大鼠海馬突觸可塑性的作用及機(jī)制研究
　　目的：
　　設(shè)置7d、14d和21d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)

13、，觀察電針對(duì)海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘密度的影響及對(duì)PKA/CREB信號(hào)通路中相關(guān)靶基因的調(diào)控作用。
　　方法：
　　首先將30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham-operated control group）、模型組（model group）、電針組（EA group）、電針+H89組（EA+H89 group）和電針+NS組（EA+NS group），7d后采用高爾基染色（Golgi染色）觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)

14、元樹突棘密度，每組6只大鼠。然后將另外75只大鼠隨機(jī)分成同上的5個(gè)組，并根據(jù)觀察時(shí)間每組又分成7d、14d和21d三個(gè)亞組，每組5只大鼠，新鮮取材后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR, RT-PCR）檢測(cè)海馬microRNA132（miR132）的表達(dá)，及采用蛋白免疫印跡（western blot）法檢測(cè)海馬區(qū)pCREB蛋白、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophi

15、c factor，BDNF）和p250GAP蛋白（GTP酶活化蛋白）的表達(dá)。永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈（two-vessel occlusion,2VO）制備腦缺血模型。術(shù)后第二天開始在百會(huì)穴（GV20）和大椎穴（GV14）施以電針治療。
　　結(jié)果：
　　1.樹突棘密度比較：在7d時(shí)，模型組較假手術(shù)組均顯著下降（P<0.01），而電針組較模型組均顯著增高（P<0.01），電針+H89組較電針+NS組均顯著降低（P<0.01）。<

16、br>　　2. pCREB蛋白表達(dá)量比較：在7d、14d和21d，模型組較假手術(shù)組均顯著下降（P<0.05）且電針組較模型組均顯著增多（P<0.05）；在7d和14d，電針+H89組較電針+NS組均明顯下降（P<0.05），但在21d時(shí)兩組 pCREB蛋白表達(dá)量差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3. BDNF蛋白表達(dá)量比較：在7d、14d和21d，模型組較假手術(shù)組均顯著下降（P<0.05）；7d和21d時(shí)電針組較模型組均

17、顯著增多（P<0.05），但在14d時(shí)電針組和模型組差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在7d、14d和21d，電針+H89組較電針+NS組均明顯下降（P<0.05）。
　　4. p250GAP蛋白表達(dá)量比較：在7d、14d和21d，模型組較假手術(shù)組均顯著增加（P<0.05）且電針組較模型組均顯著降低（P<0.05）；在7d時(shí)，電針+H89組較電針+NS組均明顯升高（P<0.05），但在14d和21d，p250GAP蛋白表達(dá)量差