長效促胰島素(laGLP-1)轉(zhuǎn)基因黃瓜研究.pdf

1、糖尿病(diabetesmellitus)是胰島素絕對或相對分泌不足以及靶組織細(xì)胞對胰島素敏感性降低所引起的代謝紊亂，臨床以高血糖、高血脂、高粘血癥為主要標(biāo)志的全身慢性代謝性臨床綜合征。近年來，糖尿病本身及其并發(fā)癥對人們的身心健康危害重大，已經(jīng)成為現(xiàn)代流行疾病的第二殺手，僅次于癌癥對人類的危害。因此，尋找更好的糖尿病藥物和治療方法是人們致力攻克的一大難題。
　　 胰高血糖素樣肽-1(glueagon-likepeptide-1，

2、GLP-1）又稱促胰島素，它是一種通過與胰島β細(xì)胞表面的特異受體相互作用而使葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌顯著增強(qiáng)的短肽。GLP-1還能減少胰島細(xì)胞損傷，改善胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)，修復(fù)胰島β細(xì)胞功能，抑制β細(xì)胞調(diào)亡，提高胰島細(xì)胞活力并延長其壽命，抑制胰升糖素的釋放，調(diào)控胰腺β細(xì)胞特異基因表達(dá)并通過這種基因調(diào)控改善葡萄糖轉(zhuǎn)運和代謝，提高β細(xì)胞對葡萄糖的反應(yīng)性以及降低食欲和抑制胃的排空等功能。GLP-1被認(rèn)為是一種從根本上治療糖尿病的“治標(biāo)治本”多功效的多

3、肽類激素，對糖尿病的治療具有重要意義。
　　 植物是最經(jīng)濟(jì)的生物反應(yīng)器，允許表達(dá)產(chǎn)物蛋白亞細(xì)胞定位，正確折疊和轉(zhuǎn)錄后修飾。目前，利用轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)生產(chǎn)了許多藥用重組蛋白和肽類。黃瓜脆嫩味美，含糖量低，是糖尿病人理想的蔬菜及水果之一。
　　 盡管天然GLP-I對糖尿病具有很好的療效，但由于體內(nèi)二肽基肽酶-IV(DPP-IV)的快速降解和腎臟代謝作用，導(dǎo)致其半衰期很短（2～5min），成為限制其臨床應(yīng)用的主要瓶頸。因而，研發(fā)

4、長效藥用GLP-1類似肽已成為學(xué)術(shù)界關(guān)注的一個熱點。本研究的目的是通過基因工程技術(shù)構(gòu)建高效表達(dá)長效laGLP-1(long-actingGLP-1)、獲得對糖尿病具有預(yù)防和治療效果的轉(zhuǎn)基因黃瓜，使患者在食用美味黃瓜的同時對糖尿病起到預(yù)防和治療作用。為此，本研究使用了在生物活性高且消除了二肽酶IV(DPPIV)位點和胰蛋白識別位點的laGLP-1基因，其表達(dá)產(chǎn)物可用于口服或食用。并且，為實現(xiàn)IaGLP-1的高效表達(dá)，本研究首次構(gòu)建了含十拷

5、貝IaGLP-1串聯(lián)重復(fù)融合基因的表達(dá)載體pX6-GLP-T。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法和floraldip法對黃瓜自交系2M1進(jìn)行轉(zhuǎn)化。獲得的轉(zhuǎn)基因黃瓜表達(dá)的多拷貝1aGLP-1融合蛋白食用后可被胃腸道內(nèi)的胰蛋白酶切割釋放有效IaGLP-1單體，發(fā)揮其促進(jìn)胰島素分泌和胰島修復(fù)功能，達(dá)到預(yù)防和治療糖尿病的作用，減輕糖尿病本身和打針吃藥給患者帶來的痛苦.
　　 本研究選用無抗生素選擇性標(biāo)記基因(marker-free)的植物表

6、達(dá)載體px6，獲得的轉(zhuǎn)基因苗通過誘導(dǎo)重組剔除抗生素選擇性標(biāo)記基因，從而獲得穩(wěn)定可靠、食用安全的轉(zhuǎn)基因黃瓜，保證其環(huán)境釋放和食用的安全性。
　　 在對黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化過程中，通過對苗齡、生長激素種類及濃度等影響器官發(fā)生的因素進(jìn)行研究，優(yōu)化了影響黃瓜子葉節(jié)經(jīng)器官發(fā)生途徑誘導(dǎo)叢生芽形成的重要因素，建立了高效、穩(wěn)定的黃瓜離體體細(xì)胞再生體系：以培養(yǎng)3-4天的無菌苗子葉節(jié)為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，附加BA2.0mg/L，NAA0

7、.5mg/L，ABA10mg/L，蔗糖60g/L，瓊脂7g/L。采用該體系外植體出芽率較高，可應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化．對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化研究結(jié)果表明，農(nóng)桿菌侵染15min，共培養(yǎng)2天，采用前7天卡那霉素延遲篩選方法出芽率最高．
　　 本研究還采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)、花粉管通道和floraldip等多種遺傳轉(zhuǎn)化方法對黃瓜自交系2MI進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。經(jīng)PCR及Southern雜交檢測，共獲得12株含有多拷貝laGLP-I基因

8、的轉(zhuǎn)基因黃瓜植株．其中，農(nóng)桿菌侵染的轉(zhuǎn)化率為0.2％，花粉管通道法的轉(zhuǎn)化率為0.09%，floraldip法的轉(zhuǎn)化率為0.52%。將獲得的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過β-雌二醇的誘導(dǎo)后，得到了marker-free轉(zhuǎn)基因黃瓜植株．進(jìn)行Westernblot分析，有2株植株呈陽性結(jié)果，分別命名為A1033，A1065。通過對A1065株系的后代進(jìn)行分析，獲得5株成功表達(dá)多拷貝laGLP-1基因的后代。
　　 以AI065植株為材料，將黃瓜果實粉

9、碎，提取總蛋白，以其濃縮物溶解液灌喂高血糖Wistar大鼠。結(jié)果表明，兩個處理組口服多拷貝IaGLP-120天后，高血糖大鼠的血糖值均顯著下降，從24.5+-2.5mM降低到13.2+-3.3mM，而正常對照組和0.9%NaCl對照組的血糖值在實驗前后均無顯著變化．表明通過給高血糖大鼠灌服多拷貝laGLP-1蛋白后，融合蛋白在胃腸道中可被胰蛋白酶降解為IaGLP-I單體，進(jìn)入血液循環(huán)進(jìn)而降低了高血糖大鼠的血糖水平。同時也改善了模型大鼠的

10、飲食、飲水平衡。
　　 本研究還利用構(gòu)建的植物病毒表達(dá)載體p35S-30B-GLP-T，采用葉片農(nóng)桿菌注射侵染法和根部吸收法兩種簡單、快捷的瞬時表達(dá)技術(shù)體系，在煙草中瞬時表達(dá)了多拷貝laGLP-1蛋白，并對瞬時表達(dá)外源蛋白的體系進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明當(dāng)菌液重懸液MMAOD600=l.0時，多拷貝laGLP-1的表達(dá)效率較高，其表達(dá)量占總可溶性蛋白的0.4%左右。證明這種植物高效瞬時表達(dá)體系可能對采用植物生物反應(yīng)器直接生產(chǎn)多肽類藥物