甘藍(lán)SCR識別結(jié)合SRK胞外域核心區(qū)的酵母雙雜交檢測及SCR相應(yīng)編碼區(qū)DNA序列的確定.pdf

1、結(jié)球甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.)是白花菜目、十字花科、蕓薹屬植物,屬于甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL.)的一個(gè)變種,其種植栽培地區(qū)已遍及全國各地,是我國主要的種植蔬菜之一。甘藍(lán)屬于雌雄同花植物,為了避免近交衰退等白花傳粉帶來的不利影響,甘藍(lán)進(jìn)化出可以造成雜交優(yōu)勢明顯的自交不親和現(xiàn)象,研究表明包括甘藍(lán)在內(nèi)的蕓薹屬植物的自交不親和性是由具有復(fù)等位基因的單一位點(diǎn)——S位點(diǎn)控制。其中自交不親

2、和反應(yīng)的起始扳機(jī)反應(yīng)是S位點(diǎn)富含半胱氨酸蛋白(S-locuscysteine-richprotein,SCR)與S位點(diǎn)受體激酶(S-receptorkinase,SRK)之間的相互作用,兩者之間相互識別和結(jié)合核心區(qū)段的位置及氨基酸殘基組成尚不完全清楚,是目前的研究熱點(diǎn)之一。本研究以結(jié)球甘藍(lán)D3的花藥cDNA為初始模板,利用巢式RT-PCR、酵母雙雜交技術(shù)深入研究了S位點(diǎn)受體激酶與S位點(diǎn)富含半胱氨酸蛋白相互作用,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:<

3、br>　　 1、SCR基因的克隆及其生物信息學(xué)分析
　　 通過SCR信號肽保守氨基酸和mRNA的ployA區(qū)設(shè)計(jì)引物,利用巢式PCR,以甘藍(lán)cDNA為模板,克隆了甘藍(lán)D3的SCR基因的部分cDNA序列,長度為319bp,包含一個(gè)開放閱讀框、3'-UTR區(qū)和ployA區(qū),編碼58個(gè)氨基酸的SCR蛋白。在二級結(jié)構(gòu)預(yù)測上,預(yù)測結(jié)果顯示序列中包含a-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)。由系統(tǒng)進(jìn)化樹可知,S3與S20的SCR親緣關(guān)系較近,說明這兩個(gè)單倍

4、型的SCR在演化過程中分支時(shí)間較晚;與S28的SCR親緣關(guān)系較遠(yuǎn),說明二者的SCR在進(jìn)化上較早時(shí)間開始分支。
　　 2、不同截短長度的S位點(diǎn)富含半胱氨酸蛋白(SCR)片段的克隆及其序列特征
　　 本研究利用高度自交不親和材料D3,提取其花藥中RNA,獲得DNA模板,然后設(shè)計(jì)引物,通過PCR技術(shù)獲得相應(yīng)的目的片段。理論分析表明各個(gè)片段其大小是292bp、256bp、239bp、66bp、90bp、135bp、141bp、1

5、44bp、60bp、108bp、78bp、54bp、63bp和33bp,可以編碼49、39、31、22、30、45、47、38、20、36、26、18、21和11個(gè)氨基酸殘基。
　　 3、母雙雜交重組誘餌質(zhì)粒的毒性及自激活檢測
　　 Y2Gold[pGBKT7SCRn]和Y2Gold[PGBKT7]轉(zhuǎn)化株在SD/-Trp平板上生長狀態(tài)良好,并且菌斑大小無明顯差異;此表明誘餌質(zhì)粒pGBKT7SCRn表達(dá)對酵母細(xì)胞無毒性作用

6、。另外,Y2Gold[pGBKT7SCRn]在SD/-Trp/x-a-Gal平板上生長、在SD/-Trp/x-a-Gal/AbA平板上不生長,其中在SD/-Trp/x-a-Gal平板上生長的菌落無明顯藍(lán)色出現(xiàn),說明pGBKT7SCRn在酵母細(xì)胞中沒有激活報(bào)告基因,無自激活現(xiàn)象出現(xiàn)。
　　 4、酵母雙雜交法檢測甘藍(lán)SCR與SRK之間的相互作用
　　 由酵母雙雜交試驗(yàn)結(jié)果表明同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)的14個(gè)實(shí)驗(yàn)組中,只有pGADT7eS

7、RKD3xpGBKT7SCR4和pGADT7eSRKD3xpGBKT7SCR5在SD/-Trp/Leu/x-a-Gal/AbA平板上長出明顯的藍(lán)色菌落,說明激活了報(bào)告基因,證明酵母雙雜交系統(tǒng)可以用于SCR與SRK發(fā)生相互作用的識別位點(diǎn)位的證明,試驗(yàn)結(jié)果還表明兩者相互作用識別位點(diǎn)位于SCR的成熟肽序列開始到Cys3之間,這從實(shí)驗(yàn)上首次證明了SCR與SRK的相互識別位點(diǎn)確實(shí)在該區(qū)域,即SCR3與其相對應(yīng)的SRK胞外域有相互作用的DNA片段位

8、于SCR的第97～186bp處。由實(shí)驗(yàn)組pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR4和pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR5在平板上長出明顯的藍(lán)色菌落,但信號肽剪切位點(diǎn)及其鄰近的幾個(gè)氨基酸殘基缺失的實(shí)驗(yàn)組pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR1和pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR13在平板上無菌落長出的結(jié)果說明信號肽剪切位點(diǎn)及其鄰近的幾個(gè)氨基酸殘基缺失的實(shí)驗(yàn)組SCR1和SCR13與eSRK無相互作用。推測這可能