甘藍(lán)SRK激酶結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的克隆及其與MLPK的雙色FISH定位研究.pdf

1、蕓薹屬自交不親和性由S位點(diǎn)所控制。SRK基因是決定自交不親和性反應(yīng)的關(guān)鍵因子，前人已經(jīng)從蕓薹屬中的甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜等物種中克隆出SRK基因。SRK基因的變異和表達(dá)量都會(huì)影響自交不親和性。SRK基因的胞外域有著較大的多態(tài)性，變異常常發(fā)生在此編碼區(qū)。相對(duì)于胞外域，激酶結(jié)構(gòu)域的保守型較強(qiáng)。本文專門對(duì)SRK基因激酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了克隆分析，以期從進(jìn)化的角度探討激酶結(jié)構(gòu)域?qū)τ谧越徊挥H和性的作用。除此之外，MLPK被證明也是SI反應(yīng)中必不可少的一個(gè)因子

2、，作為SRK下游元件起作用。本文針對(duì)這兩個(gè)基因在SI中的重要性，利用FISH技術(shù)將SRK和MLPK進(jìn)行物理定位，從而探索其在甘藍(lán)基因組中的分布及其拷貝數(shù)。得到的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.以結(jié)球甘藍(lán)263、羽衣甘藍(lán)AY627和甘藍(lán)型油菜S11為材料，采用PCR、RT-PCR等技術(shù)，分別對(duì)SRK激酶結(jié)構(gòu)域基因組DNA和cDNA進(jìn)行了擴(kuò)增、測(cè)序和序列分析，并構(gòu)建了分子進(jìn)化樹(shù)。分別獲得了1694bp和1307bp的片段、1705bp

3、和1229bp的片段和1606bp和1214bp的片段，分別編碼433，407和402個(gè)氨基酸。對(duì)獲得的片段進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，結(jié)球甘藍(lán)263包括5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，羽衣甘藍(lán)AY627和甘藍(lán)型油菜S11包括6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。并且發(fā)現(xiàn)結(jié)球甘藍(lán)263的內(nèi)含子少1個(gè)，并且有一段70bp左右的插入片段。對(duì)已報(bào)道的21種SRK基因和本文所克隆的3種材料的序列構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)三者都與S單倍型的Ⅰ類SRK基因聚在一起，Ⅱ類基因與Ⅰ類基因分為兩

4、支，擬南芥與Ⅱ類聚在一起，而蘿卜屬未形成單獨(dú)的一支。推導(dǎo)甘藍(lán)26370bp片段的插入有可能是內(nèi)含子轉(zhuǎn)化而來(lái)并導(dǎo)致了自交不親和性的產(chǎn)生。羽衣甘藍(lán)AY627與甘藍(lán)型油菜S11所獲得的片段與預(yù)期一致，激酶結(jié)構(gòu)域沒(méi)有發(fā)生片段的插入或缺失，推導(dǎo)導(dǎo)致甘藍(lán)型油菜S11自交不親和性的原因沒(méi)有發(fā)生在激酶結(jié)構(gòu)域部分。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)飛分析推導(dǎo)出蘿卜屬與蕓薹屬的分離晚于SILKⅠ類和Ⅱ類的分離。
　　 2.在FISH過(guò)程中，對(duì)甘藍(lán)根尖前中期染色體和DNA纖

5、維的制片進(jìn)行了一些條件的改變，試圖提高FISH效果。在前中期染色體制片中，本文對(duì)冷處理時(shí)間和酶解時(shí)間進(jìn)行了改變，將冷處理時(shí)間定在20h，酶解時(shí)間定在90min，制得的染色體圖片前中期分裂相較多，并且粘連程度較低，背景也較干凈。在DNA纖維制片中，細(xì)胞核的提取過(guò)程中，控制研磨力度和加入TritonX-100的量進(jìn)行了改變；DNA纖維制片時(shí)，改變了細(xì)胞核裂解液的裂解時(shí)間。通過(guò)以上改變，降低了纖維的纏繞程度。
　　 3.用經(jīng)過(guò)以上改變