嗜熱四膜蟲內(nèi)Ran結(jié)合蛋白1的功能分析.pdf

1、Ran蛋白(RanGTPase)屬于小G蛋白家族，分子量約20～30kD，具有GTP水解酶活性。Ran蛋白與伴侶分子相互作用，可在Ran-GTP/GDP結(jié)合狀態(tài)之間轉(zhuǎn)變，進而執(zhí)行不同的生理功能，可以調(diào)節(jié)染色體穩(wěn)定性、紡錘體組裝、細胞核組建以及核質(zhì)運輸?shù)榷喾N細胞進程。
　　 Ran結(jié)合蛋白1(Ran-bindingProtein1，RanBP1)是Ran蛋白的必要調(diào)控因子，含有保守Ran結(jié)合區(qū)RBD(Ran-bindingdoma

2、in)，可與Ran蛋白結(jié)合，促進Ran-GTP復(fù)合物的水解。哺乳動物細胞中的研究表明RanBP1蛋白在細胞核質(zhì)運輸、中心體的裝配、微管的聚合、紡錘體的組裝甚至細胞凋亡中都發(fā)揮著重要的作用。
　　 嗜熱四膜蟲（Tetrahymenathermophila）是一種單細胞的原生動物，存在有性生殖與無性生殖兩種生殖模式，同時具有二倍體小核和多倍體大核兩種細胞核，是研究細胞核動態(tài)變化的良好模式體系。嗜熱四膜蟲中Ran蛋白的功能研究表明其對

3、大核的無絲分裂有重要的調(diào)控作用，異常的含量表達甚至?xí)?dǎo)致細胞發(fā)育停滯。目前尚未有研究探索嗜熱四膜蟲中Ran結(jié)合蛋白1的相關(guān)功能。
　　 本研究首次從嗜熱四膜蟲大核基因組中鑒定出一個保守的Ran結(jié)合蛋白，并對其序列特征、定位及其功能進行了分析，研究結(jié)果如下:
　　 1.RBP1基因的生物信息學(xué)分析RBP1(TTHERM_00158040)基因開放讀框全長558bp，擬編碼185個氨基酸，按照四膜蟲體系規(guī)則將其編碼蛋白命名為

4、Rbp1p。相對實時熒光定量測定RBP1表達譜顯示其在四膜蟲營養(yǎng)生長和有性生殖過程中都有表達，并在有性生殖過程中表達水平提高，與四膜蟲全基因轉(zhuǎn)錄Microarray數(shù)據(jù)(http://tfgd.ihb.ae.en)中RBP1基因的表達譜相一致。多物蛋白序列對比發(fā)現(xiàn)Rbp1p含有一個保守的Ran結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)，并與Ran1蛋白具有相似的分子進化。
　　 2.Rbp1p在細胞內(nèi)的定位將含有HA-tag的載體pNeo-HA-RB

5、P1轉(zhuǎn)入野生型四膜蟲中，使其內(nèi)源性編碼HA-Rbp1p蛋白，以梯度增加巴龍霉素濃度的方法篩選陽性細胞株，使用PCR擴增鑒定。免疫熒光定位發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)生殖期，Rbp1p定位于細胞胞質(zhì)中，兩個細胞核均成“空洞”狀;在結(jié)合生殖初期Rbp1p定位于細胞質(zhì)中，細胞核無定位，而后期即“anlagen”期時，Rbp1p除了定位于細胞質(zhì)外，還定位于發(fā)生凋亡的舊大核上，直至舊大核完全凋亡。
　　 3.過表達Rbp1p導(dǎo)致細胞核分裂異常將過表達載體

6、pXS-RBP1轉(zhuǎn)入野生型四膜蟲，RBP1基因通過同源重組替代MTT1基因，使得RBP1在Cd2+誘導(dǎo)下受到MTT1基因啟動子調(diào)控而過量表達Rbp1p。結(jié)果表明Rbp1p過表達導(dǎo)致細胞生長速率下降，大核的無絲分裂異常，細胞分裂末期產(chǎn)生了無大核的異常細胞，同時導(dǎo)致了多小核的產(chǎn)生，并且上述異常依賴于Rbp1p的表達水平。
　　 4.敲減RBP1表達抑制大核無絲分裂將敲除載體pNeo-BP1轉(zhuǎn)入野生型四膜蟲，梯度增加巴龍霉素濃度篩選獲

7、得Neo4基因部分替代RBP1基因的敲減細胞株。結(jié)果表明敲減RBP1表達的細胞株生長速率下降，大核的無絲分裂受到抑制，細胞分裂末期產(chǎn)生了無大核的異常細胞。
　　 本研究首次鑒定了四膜蟲RBP1基因，RBP1的過表達和敲減均導(dǎo)致細胞異常發(fā)育，這種異常表型與GTP和GDP鎖定形式的RAN1突變體的表型相一致，暗示Rbp1p可以調(diào)節(jié)正常的Ran-GTP/GDP的濃度梯度，進而影響細胞核的發(fā)育。因此Rbp1p參與了Ran蛋白對大核無絲分