嗜熱四膜蟲中Chromodomain蛋白Tcd3和Tcd4的表達調控與功能分析.pdf

1、Chromodomain(chromatin organization modifier domain)是一個由30～50個氨基酸組成的保守的蛋白質結構域，含有Chromodomain的蛋白質廣泛存在于多種生物中的染色質結合蛋白中，通過與組蛋白或RNA的作用參與了異染色質的形成及基因的表達調控。
　　四膜蟲中程序性全基因組重排在有性生殖過程中發(fā)生，siRNA，MeH3K9，Pdd1p和Pdd3p參與這一過程，然而其詳細機制仍不清楚

2、。本研究從四膜蟲基因組中篩選到兩個含有Chromodomain的基因TCD3(Tetrahymena Chromo Domain3)與TCD4(Tetrahymena Chromo Domain4)，對這兩個基因的表達調控和細胞定位進行了研究，獲得的主要結果如下:
　　1.TCD3和TCD4序列分析通過生物信息學的方法，從四膜蟲大核基因數據庫鑒定了TCD3（TTHERM_00585180）和TCD4(TTHERM_00585190

3、)，兩個基因串聯于同一條大核染色體上，間隔237bp，兩個基因內均具有GT-AG的內含子。TCD3和TCD4基因擬編碼的蛋白334個和344個氨基酸殘基組成，分子量分別為40.26kDa和41.11kDa，等電點(pI)分別為4.590和5.435。全基因表達Microarray分析表明TCD3和TCD4在四膜蟲營養(yǎng)生殖階段和饑餓期不表達，在有性生殖過程中8h時表達量最高，并且兩者的表達譜一致。
　　2.TCD3和TCD4的5'和

4、3'-RACETCD3和TCD4的ORF分別為1005bp和1035bp，大核染色體中基因全長分別為1241bp和1429bp，各含有兩個內含子。5'RACE和3'RACE表明TCD3和TCD4的5'端非編碼區(qū)(5'-UTR)長度分別為40bp和43bp，3'端非編碼區(qū)(3'-UTR)長度分別為90bp和189bp。Chromodomain聚類分析表明Tcd3和Tcd4與pdd1p蛋白的Chromodomain最為相似，SWISS—MO

5、DEL預測發(fā)現Tcd4的Chromodomain缺失α-螺旋結構。
　　3.Tcd3和Tcd4的免疫熒光定位構建含有HA標簽的表達載體OE-PBX-TCD3和OE-PBX-TCD4,轉化四膜蟲CU428和B2086細胞株，通過巴龍霉素篩選，PCR鑒定，獲得HA-Tcd3和HA-Tcd4的過表達細胞株。激光共聚焦顯微鏡對HA-Tcd3和HA-Tcd4的免疫熒光定位發(fā)現:HA-Tcd3定位于四膜蟲有性生殖核發(fā)育的親本大核和新發(fā)育的大核

6、中;HA-Tcd4則定位于conjusome和新發(fā)育的大核中。
　　TCD3和TCD4相似的序列特征，保守的Chromodomain位置，一致的表達譜，表明兩個基因中的一個很可能源于基因復制，進而加強該基因的功能。TCD3和TCD4在四膜蟲接合生殖時期特異表達，都能夠定位于新的發(fā)育的大核中，表明Tcd3和Tcd4極有可能參與了新的大核發(fā)育過程中程序性基因組重排。Tcd3和Tcd4在親本大核和conjusome特異的定位，以及不同的