受磷蛋白及鈣--ATP酶的生成、轉(zhuǎn)運，對正常及心肌梗死大鼠心肌細胞鈣調(diào)控的影響.pdf

1、本文主要從以下幾部分進行論述：
　　第一章 成年SD大鼠原代心肌細胞分離培養(yǎng)，PLB及SERCA2a重組腺病毒載體的純化及轉(zhuǎn)染
　　目的：
　　分離得到成年大鼠原代心肌細胞并成功培養(yǎng)，分離、純化包含犬PLB和SERCA的腺病毒載體，并轉(zhuǎn)染至分離成功的大鼠原代心肌細胞中;
　　方法：
　　采用Lan'gendorff灌流法及Liberase酶解法分離得到成年SD大鼠原代心肌細胞，進一步分離純化包含犬PLB和S

2、ERCA的腺病毒載體，并轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的原代心肌細胞中，觀察細胞存活時間及細胞狀態(tài)，通過免疫組化法、western blot、calcium-imaging觀察未轉(zhuǎn)染細胞及轉(zhuǎn)染成功后，心肌細胞PLB及SERCA分布、單個細胞功能等。
　　結(jié)果：
　　1.成功分離出大鼠原代心肌細胞，分離存活率穩(wěn)定在70-80％，并可穩(wěn)定培養(yǎng)3-5天;
　　2.包含犬PLB和SERCA2a的腺病毒載體經(jīng)分離純化，效價比較高，并可成功轉(zhuǎn)染cos

3、-1細胞，肉眼觀測轉(zhuǎn)染成功率達80％以上，western blot檢測到新生蛋白成功表達，且含量隨病毒濃度增加呈遞增趨勢;
　　結(jié)論：
　　Lan'gendorff灌流法分離大鼠原代心肌細胞方法有效可行，成功率高，分離純化重組腺病毒載體方法成熟且轉(zhuǎn)染率高，分離及轉(zhuǎn)染后原代心肌細胞狀態(tài)穩(wěn)定，可進行后續(xù)實驗。
　　第二章 正常SD大鼠原代心肌細胞中新生PLB及SERCA2a運輸途徑及其對心肌細胞自發(fā)鈣活動、鈣離子通道的影響

4、
　　目的：
　　通過觀察大鼠原代心肌細胞培養(yǎng)24h、48h、72h后，觀察新生PLB和SERCA從細胞核到細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運途徑，探討該新生轉(zhuǎn)運途徑對心肌細胞自發(fā)鈣活動及L型鈣離子通道的影響;
　　方法：
　　健康成年SD大鼠8只，采用Lan'gendorff灌流法及Liberase酶解法分離得到成年SD大鼠原代心肌細胞，包含犬PLB和SERCA的腺病毒載體轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的原代心肌細胞中，觀察轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h

5、存活細胞狀態(tài)，通過免疫組化法、western blot、calcium-imaging、膜片鉗等方法觀察心肌細胞中新生成的PLB及SERCA分布、由細胞核向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運的途徑、對細胞鈣離子電流的影響等。結(jié)果以x±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用方差分析，不同距離/時間點資料的比較應(yīng)用重復(fù)測量方差分析，p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，所有統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS24.0軟件完成。
　　結(jié)果：
　　1.8

6、只SD大鼠均成功分離出原代心肌細胞，轉(zhuǎn)染成功，并可培養(yǎng)24h、48h、72h;
　　2.正常原代心肌細胞中，PLB在核膜及肌漿網(wǎng)上均有分布，且兩者分布含量大于2∶1; SERCA2a在核膜及肌漿網(wǎng)上同樣均有分布，且兩者分布含量約為1∶1，p＜0.05;
　　3.包含犬PLB/SERCA2a的重組腺病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的心肌細胞后，24h熒光染色結(jié)果可見PLB主要局限在核膜上，而SERCA2a已經(jīng)開始由核膜向外擴散，觀察48h熒光染色

7、結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PLB仍然以核膜為主，部分分布在肌漿網(wǎng)上，SERCA2a則已經(jīng)完全分布至肌漿網(wǎng)，接近自身穩(wěn)態(tài)的分布;72h觀察兩者均已達到穩(wěn)態(tài)分布，westernblot結(jié)果與熒光染色觀察結(jié)果一直，細胞內(nèi)新生的PLB/SERCA2a含量隨著時間延長呈遞增趨勢;
　　4.對比轉(zhuǎn)染前后心肌細胞鈣成像及全細胞膜片鉗實驗結(jié)果，轉(zhuǎn)染后心肌細胞自發(fā)鈣活動并未發(fā)生明顯改變，L型鈣通道電流沒有明顯影響，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義;
　　結(jié)論：
　　

8、正常大鼠心肌細胞中新生PLB及SERCA2a遵循NEST途徑轉(zhuǎn)運，PLB在轉(zhuǎn)運途中在核膜上的滯留及其自身的分布特點對正常心肌細胞的鈣調(diào)控未見明顯影響。
　　第三章 心肌梗死SD大鼠原代心肌細胞PLB及SERCA2a的運輸途徑，及其對心肌細胞自發(fā)鈣活動、鈣離子電流的影響
　　目的：
　　心肌梗死大鼠原代心肌細胞培養(yǎng)24h、48h、72h后，觀察新生PLB和SERCA從細胞核到細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運途徑，探討該新生轉(zhuǎn)運途徑對心肌細胞自

9、發(fā)鈣活動及鈣離子通道的影響;
　　方法：
　　健康成年SD大鼠8只，結(jié)扎前降支構(gòu)建梗死模型，造模成功后飼養(yǎng)4周，采用Lan'gendorff灌流法及Liberase酶解法分離得到成年SD大鼠原代心肌細胞，將含犬PLB和SERCA的腺病毒載體轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的原代心肌細胞中，觀察轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h，存活細胞狀態(tài)，通過免疫組化法、western blot法、 calcium-imaging、全細胞膜片鉗等方法觀察心肌細胞中新

10、生成的PLB及SERCA分布、由細胞核向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運的途徑、對心肌細胞自發(fā)鈣活動、相關(guān)電生理功能的影響等。結(jié)果以x±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用方差分析，不同距離/時間點資料的比較應(yīng)用重復(fù)測量方差分析，p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，所有統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS24.0軟件完成
　　結(jié)果：
　　1.8只心梗大鼠均成功分離出原代心肌細胞，轉(zhuǎn)染后可成功培養(yǎng)24h、48h、72h;
　　2.心梗鼠

11、的腺病毒轉(zhuǎn)染后的原代心肌細胞中，24h熒光染色結(jié)果可見PLB主要局限在核膜上，而SERCA2a已經(jīng)開始由核膜向外擴散，觀察48h熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PLB仍然以核膜為主，SERCA2a則已經(jīng)完全分布至肌漿網(wǎng)，接近自身穩(wěn)態(tài)的分布;72h觀察兩者均已達到穩(wěn)態(tài)分布，western blot結(jié)果與熒光染色觀察結(jié)果一直，細胞內(nèi)新生的PLB/SERCA2a含量隨著時間延長呈遞增趨勢;
　　3.對比轉(zhuǎn)染前后心梗鼠心肌細胞鈣成像實驗結(jié)果，轉(zhuǎn)染后的心

12、肌細胞自發(fā)鈣活動明顯增加，熒光強度較未轉(zhuǎn)染的心肌細胞增強(p＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義);采用全細胞膜片鉗記錄未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后24小時的心肌細胞L型鈣通道電流，分別記錄轉(zhuǎn)染、未轉(zhuǎn)染細胞各12個，記錄到的鈣電流在轉(zhuǎn)染后，較未轉(zhuǎn)染細胞的鈣電流減少，p＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　心梗大鼠心肌細胞中新生PLB及SERCA2a同樣遵循NEST途徑轉(zhuǎn)運，PLB在轉(zhuǎn)運途中在核膜上的滯留時間較正常細胞延長，與未轉(zhuǎn)染細