雌激素誘導(dǎo)NKT細胞及其功能.pdf

1、第一部分雌激素體外誘導(dǎo)NKT細胞
　　 目的:建立雌激素(Estrgen,E2)體外誘導(dǎo)自然殺傷T細胞(NaturalKiller T cells,NKT)的方法,初步探討雌激素對反應(yīng)細胞增殖的抑制功能的機制。
　　 方法:1、建立以C57BL/6小鼠脾臟單個核細胞為反應(yīng)細胞,CD3,CD28單克隆抗體為刺激原的單向混合淋巴細胞培養(yǎng)(Mixed lymphocyte culture,MLC)體系,72小時后用流式細胞儀檢

2、測反應(yīng)細胞羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)變化情況,分析雌激素對其增殖的影響；2、利用絲裂霉素(Mitomycin,MMC)處理的BALB/c小鼠脾臟單個核細胞為刺激細胞建立體外誘導(dǎo)NKT細胞的體系,分析雌激素,分化抗原1d(Cluster ofDifferentiation1d,CD1d)單克隆抗體對NKT細胞的構(gòu)成的影響和Prox1、Nrsf,Nr

3、p1、Foxp3表達的影響。
　　 結(jié)果:1、加入雌激素后C57BL/6脾細胞的增殖指數(shù)(Proliferaation Index,PI)由6.56±0.056降為3.59±0.025(P<0.01)；2、分別加入雌激素、PPT后,增殖指數(shù)分別為37.85±0.30,34.57±0.19,(兩者比較P<0.05)與對照組比較(42.33±0.22),P<0.05；3、混培體系中加入雌激素后,NKT占CD3+細胞的比例(6.10±

4、0.26 VS2.55±0.21,P<0.05),CD4+細胞中NKT的比例(5.20±0.46 VS3.10±0.25,P<0.05),CD8+細胞中NKT的比例(3.70±0.36 VS2.0±0.15,P<0.05),CD4+NKT在NKT細胞中的比例均升高(23.43±1.07 VS14.50±3.05,P<0.05),CD4-CD8-NKT在NKT細胞中比例降低(54.36±1.02 VS62.44±1.18,P<0.05),

5、CD8+NKT在NKT細胞中的比例無明顯變化(26.43±1.22 VS23.05±1.94,P>0.05)；混培體系中加入CD1d抗體后,各組分無明顯變化；而在混培體系中同時加入雌激素和CD1d抗體后,與單獨加入雌激素組比較,NKT占CD3+細胞的比例(5.35±0.26 VS6.10±0.26,P<0.05),CD4+細胞中NKT的比例(4.35±0.40 VS5.20±0.46,P<0.05),CD8+細胞中NKT的比例(2.15

6、±0.46 VS3.70±0.36,P<0.05),CD4+NKT(21.25±2.45 VS23.43±1.07,P<0.05)、CD8+NKT(15.55±2.65 VS26.43±1.22,P<0.05)在NKT細胞中的比例均略降低,CD4-CD8-NKT(64.61±1.67 VS54.36±1.02,P<0.05)比例略升高；4、與對照組比較,加入雌激素或CD1d單克隆抗體后,Prox1、Nrsf,Nrp1、Foxp3的表達均

7、升高(2.1,3.65,1.76,232.36VS1；2.64,2.10,6.90,885.47 VS1)；同時加入兩者,各基因的表達量均較單獨作用時降低(1.17,2.91,4.64,524.34)；加入PPT后,Prox1、Foxp3(0.95,1.15)的表達無明顯改變,Nrsf、Nrp1表達升高(11.0,1775.92)。
　　 結(jié)論:妊娠濃度的雌激素可抑制MLC中反應(yīng)細胞的增殖；雌激素通過促進增殖抑制相關(guān)基因的表達和

8、調(diào)節(jié)性T細胞功能相關(guān)的基因的表達,直接或間接(通過調(diào)節(jié)性T細胞)發(fā)揮增殖抑制作用；其中,促Nrsf和Nrpl表達主要通過ERQ發(fā)揮。雌激素在體外可誘導(dǎo)NKT細胞,CD1d抗體單獨作用,對NKT細胞的比例及構(gòu)成無明顯影響。
　　 第二部分 E2體外誘導(dǎo)NKT細胞的免疫調(diào)節(jié)功能
　　 目的:探討雌激素體外誘導(dǎo)的NKT細胞的免疫調(diào)節(jié)功能。
　　 方法:1、建立以C57BL/6小鼠脾臟CD4+CD25-、CD4+CD25

9、+細胞為反應(yīng)細胞,CD3,CD28單克隆抗體為刺激原的單向混合淋巴細胞培養(yǎng)體系,加入體外誘導(dǎo)的NKT細胞共孵育,72小時后用流式細胞儀檢測反應(yīng)細胞CFSE變化情況,和兩種細胞比例變化；2、利用絲裂霉素(MMC)處理的BALB/c小鼠脾臟單個核細胞(Bm)或C3H小鼠脾臟單個核細胞(C3H)為刺激細胞,C57BL/6小鼠脾臟單個核細胞為反應(yīng)細胞,建立MLC體系,加入NKT細胞或者Na(i)ve CD4+CD25+T細胞共孵育,72小時后分

10、析反應(yīng)細胞的增殖情況。
　　 結(jié)果:1、經(jīng)與CD3,CD28抗體共孵育后,CD4+CD25-、CD4+CD25+細胞的增殖指數(shù)為6.21±0.31、3.11±0.26;加入NKT細胞后,增殖指數(shù)分別為3.35±0.32,2.18±0.19各組兩兩比較,P≤0.01；2、NKT細胞、CD4+CD25+細胞對Bm、C3H刺激的C57小鼠脾細胞的增殖抑制率分別為:(24.82±3.40)％、(24.28±3.64)％,(14.32±1

11、.47)％、(23.60±2.24)％:CD4+CD25+(C3H)組和NKT(Bm)組與CD4+CD25+(Bm)組比較,CD4+CD25+(C3H)組與NKT(C3H)組比較,P>0.05；NKT(Bm)組與NKT(C3H)組比較,P<0.05。
　　 結(jié)論:雌激素體外誘導(dǎo)NTK細胞在體外具備抗原特異性的免疫調(diào)節(jié)功能。
　　 第三部分 E2體外誘導(dǎo)NKT細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的機制
　　 目的:探討雌激素體外誘

12、導(dǎo)的NKT細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的可能機制及CD1d阻斷抗體對NKT細胞體外調(diào)節(jié)功能的影響。
　　 方法:1、建立以C57BL/6小鼠脾臟CD4+CD25-、CD4+CD25+細胞為反應(yīng)細胞,MMC處理的BALB/c小鼠脾臟單個核細胞為刺激原的單向混合淋巴細胞培養(yǎng)體系,加入體外誘導(dǎo)的NKT細胞共孵育,72小時后用流式細胞儀檢測反應(yīng)細胞CFSE變化情況和兩種細胞比例變化；2、利用絲裂霉素(MMC)處理的BALB/c小鼠脾臟單個核細胞

13、(Bm)為刺激細胞,C57BL/6小鼠脾臟單個核細胞為反應(yīng)細胞,建立MLC體系,加入NKT細胞和/或CD1d單克隆抗體共孵育,72小時后分析反應(yīng)細胞的增殖情況。
　　 結(jié)果:1、CFSE+CD4+CD25-細胞、CFSE+CD4+CD25+細胞與MMC處理的BALB/c小鼠脾臟單個核細胞共培養(yǎng)72小時后,CFSE+細胞中CD4+CD25+細胞的比例分別為:0.37±0.15、50.43±2.87；加入NKT細胞后,CD4+CD2

14、5+細胞的比例分別為3.03±0.90,49.07±3.35,CD4+CD25-Bm組與加入NKT后比較,P<0.01,CD4+CD25+Bm組與加入NKT后比較P>0.05；2、經(jīng)與絲裂霉素處理的BALB/c小鼠脾細胞共孵育72小時后,C57小鼠脾細胞的增殖指數(shù)為4.74±0.17；加入NKT細胞、CD1d單克隆抗體后,增殖指數(shù)分別為2.86±0.06,3.56±0.11；同時加入NKT細胞、CD1d單克隆抗體后,增殖指數(shù)為3.61±

15、0.07,除NKT+CD1d組與CD1d組無差異外,其他各組兩兩比較,P<0.01。
　　 結(jié)論:1、雌激素體外誘導(dǎo)的NKT細胞可誘導(dǎo)CD4+CD25-細胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+細胞；2、CD1d單克隆抗體可部分阻斷NKT細胞的體外調(diào)節(jié)功能。
　　 第四部分 E2體內(nèi)誘導(dǎo)NKT(NKTvivo)細胞免疫調(diào)節(jié)功能
　　 目的:探討雌激素體內(nèi)誘導(dǎo)NKT細胞的可能性及其免疫調(diào)節(jié)功能。
　　 方法:1、取5X1

16、06個MMC處理的BALB/c小鼠脾臟單個核細胞,用PBS洗滌后經(jīng)尾靜脈注入C57BL/6小鼠,每天自C57BL/6小鼠尾靜脈輸注雌激素,使血清雌激素達妊娠水平,連續(xù)7天,取C57BL/6小鼠脾臟單個核細胞,分析NKT細胞的比例；2、建立以C57BL/6小鼠脾臟單個核細胞為反應(yīng)細胞,MMC處理的BALB/c小鼠脾臟單個核細胞為刺激細胞的單向混合淋巴細胞培養(yǎng)體系,加入體內(nèi)誘導(dǎo)的NKT細胞或者CD4+CD25+細胞共孵育,72小時后用流式細

17、胞儀檢測反應(yīng)細胞CFSE變化情況；3、建立BALB/c小鼠到C57BL/6小鼠的皮膚移植模型,過繼輸注體內(nèi)誘導(dǎo)的NKT細胞,觀察皮膚移植物的存活情況。
　　 結(jié)果:1、雌激素體內(nèi)誘導(dǎo)可使NKT占CD3+細胞的比例升高(4.8±0.56 VS2.97±0.21,P<0.05),CD4+細胞中NKT的比例升高(9.43±1.0 VS3.77±0.42,P<0.05)；而CD8+細胞中NKT的比例(0.38±0.10VS0.5±0.1

18、,P>0.05),CD4+NKT在NKT細胞中的比例(89.27±1.7 VS86.67±0.6,P>0.05),CD4-CD8-NKT、CD8+NKT在NKT細胞中的比例(4.43±1.16 VS3.4±0.53,P>0.05;8.12±1.82 VS9.68±0.68,P>0.05)無明顯變化；2、加入體內(nèi)誘導(dǎo)的NKT細胞、Naive CD4+CD25+后,C57小鼠脾細胞增殖指數(shù)分別為5.17±0.15,5.21±0.17,兩組比

19、較P>0.05,均比對照組(6.88±0.11,P<0.01)降低；3、過繼輸注體內(nèi)誘導(dǎo)NKT細胞和CD4+CD25+細胞后,移植皮膚的生存時間分別是:16.38±0.35天；16.83±0.47天(與NKT組比較P>0.05)；PBS對照組的移植皮膚生存13.5±0.82天,兩實驗組與對照組比較,P<0.01。
　　 結(jié)論:1、雌激素體內(nèi)可誘導(dǎo)NKT細胞；2、在體外,體內(nèi)誘導(dǎo)的NTK細胞有與Na(i)veCD4+CD25+類似