紫球藻多糖的制備及其生物活性研究.pdf

1、紫球藻(Porphyrodium cruentum)是紅藻門中唯一的單細(xì)胞類群，在生長過程中能合成一類細(xì)胞外多糖(Extracellular polysaccharide，EPS)，其產(chǎn)量很大程度上受到培養(yǎng)條件的影響。國內(nèi)外關(guān)于紫球藻的培養(yǎng)和活性成分的研究取得了一定進(jìn)展，但有關(guān)紫球藻多糖分子修飾，尤其是在紫球藻多糖結(jié)構(gòu)與其生物活性之間的關(guān)系研究方面尚不多見。本文采用生態(tài)調(diào)控和工藝培養(yǎng)條件優(yōu)化等手段，有效地提高了紫球藻多糖的產(chǎn)量，為紫球藻

2、多糖的大量制備奠定了良好的基礎(chǔ)。在紫球藻多糖理化性質(zhì)研究和結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上，利用對多糖的降解和分子修飾等手段獲得了多種不同分子質(zhì)量和不同硫酸基含量的多糖，并對這些不同性質(zhì)多糖的抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性以及生物活性與分子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)的研究，取得了以下研究結(jié)果： 1、提高紫球藻多糖產(chǎn)量的培養(yǎng)條件 (1)通過考察無機(jī)鹽、金屬離子及植物生長激素等對紫球藻多糖合成的影響，獲得了有利于提高多糖產(chǎn)量的培養(yǎng)基配方(OCM

3、II)：NaHCO33.5g，KH2PO420 mg，NaNO32 g，Na2SO420 mg，F(xiàn)eCl2·6H2O10μM，MnCl2·4H2O0.2μM，VB10.9 mg，VB122.7μg，無菌海水1000mL。采用OCMII培養(yǎng)基、15d培養(yǎng)，紫球藻多糖的最大產(chǎn)量達(dá)到了672 mg/L，分別比2/f和Koch對照培養(yǎng)基的多糖產(chǎn)量提高了1.79和1.62倍。 (2)在自行研制的平板式光生物反應(yīng)器中，考察了光照密度、光照時

4、間、光質(zhì)和反應(yīng)器光徑對紫球藻多糖合成的影響。在光通量密度為80μE·m-2s-1、光暗循環(huán)周期為18:6、自然光照射條件下，多糖的產(chǎn)量達(dá)到0.96 g/L。在光徑為30 mm的反應(yīng)器中多糖產(chǎn)量高達(dá)1.13 g/L，而在光徑為50 mm的反應(yīng)器中多糖的面積產(chǎn)率最高達(dá)到5.80 g/m2/d的水平。 (3)采用均勻設(shè)計法對紫球藻半連續(xù)培養(yǎng)的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在NaNO3濃度、更新速率和更新周期分別為3.5 g/L、27％和2.91d

5、的優(yōu)化條件下，經(jīng)過23d的培養(yǎng)，紫球藻多糖的總采收量達(dá)到29.4 g，平均多糖產(chǎn)量為1.96 g/L，分別是批式培養(yǎng)的2.35和1.57倍。 2、不同性質(zhì)紫球藻多糖的制備及其結(jié)構(gòu)性質(zhì)分析 (1)利用DE52離子交換柱層析及Sephacryl S-400凝膠過濾柱層析獲得了純化的多糖。該多糖的平均分子量為2918 kDa，硫酸基含量14.63％，糖醛酸含量7.8％；多糖溶液為典型的假塑性流體特征，其粘度不受溫度、加熱時間等

6、的影響。GC分析表明該多糖由木糖、葡萄糖和半乳糖組成，為一種雜多糖，其摩爾比為：2.96:1.25:3.06；化學(xué)分析和光譜分析結(jié)果表明紫球藻多糖糖鏈連接方式以β-(1→3)為主，存在少量1→4及1←6糖苷鍵；Gal在支鏈或鏈末端有較大量的存在，Xyl和Glc在主鏈或靠近主鏈區(qū)域有特定分布。綜合上述分析，推斷EPS可能的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)如下： (2)采用密閉微波降解技術(shù)分別制備了相對分子量分別為6553 Da、60.66 kDa、和

7、256.26 kDa的小分子量多糖；采用超聲波輔助過氧化氫降解技術(shù)分別制備了203.6kDa、606.6 kDa、802.6 kDa、903.3 kDa和1002 kDa的小分子量多糖。通過控制不同的衍生溫度制備了硫酸根含量分別為31.0％、31.5％、47.5％和42.4％的硫酸酯多糖衍生物。降解后的小分子量多糖的理化性質(zhì)沒有明顯的變化，衍生化后紫球藻多糖的水溶性明顯增加。 3、紫球藻多糖的生物學(xué)活性 (1)紫球藻多糖

8、的抗氧化活性所制備的各類紫球藻多糖均表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除羥自由基(·OH)、超氧陰離子(O2-·)自由基和1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH·)自由基的活性，并且清除作用均與其濃度正相關(guān)；對由Fe2+/抗壞血酸誘發(fā)的小鼠肝勻漿氧化損傷和由H2O2誘發(fā)的小鼠紅細(xì)胞氧化溶血也具有濃度依賴性的抑制作用。 多糖分子量對其抗氧化活性有顯著的影響，降解前原糖樣的抗氧化活性未能檢測出，但是降解后隨著多糖分子量的減小其抗氧化活性顯著增加，尤其是分子量

9、為6553Da的多糖的抗氧化效果最好。經(jīng)過硫酸化修飾后，多糖的抗氧化活性明顯增加，對·OH和O2-·的半數(shù)抑制濃度分別為3.92 mg/mL和0.4mg/mL；隨著硫酸基含量的增加，衍生化多糖對三種自由基的清除效果明顯增強(qiáng)，但是差異不十分顯著。 (2)紫球藻多糖的抗腫瘤作用 SRB法測定紫球藻體外抗腫瘤活性，結(jié)果表明高分子量的紫球藻多糖沒有體外抑瘤效果，分子量為6.55 kDa和256 kDa的多糖對肺腺癌癌細(xì)胞(A549)和喉

10、表皮樣癌癌細(xì)胞(Hep-2)和肝癌細(xì)胞株(SMMC7721)表現(xiàn)出一定的抑制作用。 荷S180實體瘤小鼠灌胃給藥的結(jié)果顯示，高、中、低三個劑量組(200、100、50mg/kg/d)的紫球藻多糖均可顯著抑制S180實體瘤的生長，其抑瘤率分別為53.3％、47.5％和40.5％，表明該多糖具有明顯的抗腫瘤作用。并且紫球藻多糖能顯著地提高荷瘤小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，明顯促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖。在劑量為200μg/mL時，脾淋巴細(xì)胞的增

11、殖指數(shù)相對于模型組為2.41，相對于CTX陽性對照組為2.15。 (3)紫球藻多糖的體外免疫活性在25～200μg/mL濃度范圍內(nèi)，紫球藻多糖能顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO能力，增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力，促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞的增殖。分子量與硫酸基含量對免疫調(diào)節(jié)功能有顯著影響。分子量為6.55 kDa的多糖的免疫增強(qiáng)活性最強(qiáng)；除了硫酸基含量為32％的多糖對腹腔巨噬細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用最強(qiáng)外，其余都是隨著硫