慢性乙型肝炎患者M(jìn)MP-1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的研究.pdf

1、研究目的
　　本研究旨在檢測(cè)慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中基質(zhì)金屬蛋白酶-1(Matrix Metalloproteinase-1，MMP-1)啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，研究MMP-1啟動(dòng)子的甲基化率與CHB患者肝纖維化嚴(yán)重程度之間的聯(lián)系，從而探究外周血MMP-1基因啟動(dòng)子甲基化在CHB患者臨床診

2、治中的價(jià)值。
　　研究方法
　　1.病例選擇:本研究納入CHB患者137例為實(shí)驗(yàn)組，均采用經(jīng)皮肝穿刺活檢術(shù)取得肝臟組織，采納Edmondson分級(jí)法對(duì)病理切片進(jìn)行病理學(xué)分級(jí)，其中S0期46人;S1期44人;S2期24人;S3期17人;S4期6人;G0期19人;G1期68人;G2期32人;G3期13人;G4期5人。所有患者均為2013年1月至2015年8月期間在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院肝病科門診和病房住院患者，CHB的診斷的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2

3、009年美國(guó)肝病研究協(xié)會(huì)(American Association for the Study ofLiver Diseases，AASLD)診療指南。納入健康志愿者28例作為對(duì)照組，來(lái)自于山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院的志愿者，無(wú)肝炎病毒感染史，肝功正常，無(wú)其他系統(tǒng)疾病。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法:應(yīng)用試劑盒從PBMCs中提取DNA，重亞硫酸鹽處理行DNA甲基化修飾，運(yùn)用在線MethPrimer軟件設(shè)計(jì)引物，根據(jù)修飾后的DNA序列，通過(guò)甲基化特異性聚合

4、酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Methylation specific polymerase chain reaction，MSP)來(lái)檢測(cè)修飾后的DNA標(biāo)本中MMP-1基因啟動(dòng)子是否能擴(kuò)增出相應(yīng)的甲基化或非甲基化片段，若甲基化(M)引物能夠擴(kuò)增出相應(yīng)片段，則表示MMP-1啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生了甲基化。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析均應(yīng)用SSPS16.0軟件進(jìn)行。應(yīng)用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布;偏態(tài)分布的連續(xù)

5、變量用中位數(shù)描述，分類變量用相對(duì)頻數(shù)來(lái)描述;Mann-Whitney U檢驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)數(shù)值變量之間是否有差異，而應(yīng)用卡方檢驗(yàn)來(lái)比較分類變量之間是否存在差異。我們應(yīng)用卡方檢驗(yàn)Fisher確切概率法、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來(lái)比較CHB患者及正常對(duì)照組之間血清MMP-1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的差異性以及CHB患者外周血MMP-1啟動(dòng)子甲基化率與其臨床病理特征之間的相關(guān)性。MMP-1啟動(dòng)子甲基化以及谷草轉(zhuǎn)氨酶、血小板計(jì)數(shù)比值(Aminotransferase

6、to platelet ratio index，APRI score)的診斷價(jià)值由ROC曲線下面積來(lái)表示。P值小于0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果
　　1.CHB患者外周血中MMP-1啟動(dòng)子甲基化率明顯高于健康對(duì)照者(x2=31.23，p＜0.001);
　　2.MMP-1啟動(dòng)子甲基化率在S0與S1(p=0.048)，S0與S3-4(p＜0.001)，S1與S3-4(p=0.016)，S2與S3-4(p=0.

7、023)之間存在顯著差異，而在S0與S2(p=0.091)，S1與S2(p=0.974)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　3.MMP-1啟動(dòng)子甲基化率在G0與G2(p=0.004)，G0與G3-4(p＜0.001)，G1與G2(p=0.016)，G1與G3-4(p=0.022)之間存在顯著差異，而在G0與G1(p=0.319)，G2與G3-4(p=0.667)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　4.MMP-1啟動(dòng)子甲基化與CHB患者年齡(

8、p=0.188)、性別(p=0.884)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)(p=0.081)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartateaminotransferase，AST)(p=0.142)、乙型肝炎病毒e抗原(Hepatitis B e antigen，HBeAg)(p=0.283)及Log10(HBV-DNA)(p=0.355)等臨床特征參數(shù)之間無(wú)顯著相關(guān)性;
　　5.MMP-1基因啟動(dòng)子甲基化

9、對(duì)CHB患者肝纖維化嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)價(jià)值:受試者工作曲線下面積(the area under the receiver operating characteristic curve，AUC)為0.771，明顯高于APRI score(p=0.041)。
　　結(jié)論
　　1.CHB患者組中外周血MMP-1啟動(dòng)子甲基化率升高，與健康對(duì)照組相比，其血清MMP-1基因啟動(dòng)子甲基化程度顯著升高，提示CHB患者外周血中存在MMP-1啟動(dòng)子區(qū)

10、域存在異常甲基化;
　　2.CHB患者組外周血MMP-1基因啟動(dòng)子甲基化率隨患者肝纖維化嚴(yán)重程度的增加而升高，與肝纖維化嚴(yán)重程度呈顯著相關(guān)，提示MMP-1基因啟動(dòng)子甲基化在CHB患者肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了重要作用;
　　3.CHB患者組外周血MMP-1基因啟動(dòng)子甲基化率隨患者肝組織炎癥程度分級(jí)的增高而增高，提示MMP-1基因啟動(dòng)子甲基化可能參與肝臟的抗炎反應(yīng)機(jī)制，在炎癥的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮作用;
　　4.外周血MM