UC001kfo通過調(diào)控α-SMA對肝癌細胞株HepG2生物學(xué)行為的影響.pdf

1、研究背景:
　　原發(fā)性肝癌是來源肝臟上皮組織的惡性腫瘤，是全球第五位最常見的癌癥和第三位最常見的癌癥死因，全世界每年約有63萬肝癌新發(fā)病例而超過半數(shù)的新病例發(fā)生在中國[1]，目前，外科切除和肝移植仍是最有效治療早期階段肝癌的方法，盡管如此，患者五年內(nèi)手術(shù)部位復(fù)發(fā)率高達70％[2]，而腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后差的主要原因。嚴(yán)格的手術(shù)指征，肝臟捐贈者的限制和高昂的成本造成肝移植只適用于少數(shù)患者。近年來，隨著高通量、高分辨的成像及

2、實驗技術(shù)的發(fā)展，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA lncRNA)與疾病發(fā)生發(fā)展機制的密切相關(guān)性逐漸顯現(xiàn)，尤其是lncRNA對腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、增殖和凋亡等生物學(xué)行為的調(diào)控效應(yīng)備受關(guān)注[3-5]。
　　lncRNA廣泛存在于真核生物的細胞核與細胞質(zhì)中，一般長度為200bp-100kb，缺乏開放式閱讀框，不能編碼蛋白質(zhì)，起初甚至被認為是“轉(zhuǎn)錄噪音”[6-8]，近年來，對lncRNA的研究逐漸取得進展，有越來越多的證

3、據(jù)表明lncRNA與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
　　前期實驗我們采用基因芯片技術(shù)在肝癌組織中篩選出一個肝癌相關(guān)新基因名為UC00lkfo，其長度為2043bp，基因編碼區(qū)與α-平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actinα-SMA）的編碼基因ACTA2發(fā)生部分重疊，應(yīng)用基因組瀏覽器和RNAplex預(yù)測 ACTA2為 UC001kfo的靶基因，進一步研究發(fā)現(xiàn) UC001 kfo和α-SMA在肝癌組織較癌周組織中

4、表達顯著性升高，并且在不同侵襲能力肝癌細胞中的表達量不同。后在人肝癌組織及細胞模型的基礎(chǔ)上利用RT-PCR、原位雜交、免疫組化和細胞侵襲等實驗進一步證明UC001kfo是具有調(diào)節(jié)功能的長鏈非編碼 RNA，能夠促進肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移?？傊?，前期實驗表明 UC001kfo的靶基因為 ACTA2，靶蛋白為α-SAM，UC001kfo與肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。為了更進一步分析UC001kfo與α-SAM的相互作用機制，我們已經(jīng)采用siRNA干擾

5、技術(shù)下調(diào)UC001kfo的表達，RT-PCR的方法檢測了α-SAM的mRNA表達，采用 Western Blot的方法檢測了α-SAM的蛋白表達，結(jié)果兩者顯著相關(guān)，從mRNA和蛋白水平分別驗證下調(diào)UC001kfo后α-SAM的表達減少[9].
　　α-SMA是肌動蛋白的一種，后者以單體和多聚體形式存在。單體的肌動蛋白即球狀肌動蛋白(globular actin, G-actin)。肌動蛋白的多聚體形成肌動蛋白絲即纖維狀肌動蛋白(f

6、ibros actin, F-actin)，肌動蛋白至少表達成6種異構(gòu)形式，根據(jù)等電點的不同，將其分為分為α、β、γ三類，α分布于各種肌肉細胞中，其中α-平滑肌肌動蛋白參與細胞形態(tài)的維持，參與構(gòu)成真核細胞的微絲結(jié)構(gòu)，是構(gòu)成細胞骨架和收縮構(gòu)件的主要成分，肌動蛋白的聚合和解聚參與細胞骨架的重塑，影響細胞運動，因此，α-SMA是調(diào)節(jié)細胞運動的基礎(chǔ)[10]。另外，a-SMA是肝癌相關(guān)肌纖維母細胞(carcinoma-associated fib

7、roblasts CAF)的重要細胞成分，在肝癌細胞旁分泌機制作用下，癌旁組織成纖維細胞（paired peritumoral tissue fibroblasts PTF）表達a-SMA向CAF表型分化，結(jié)果PTF發(fā)生遷移和侵襲[11]。研究表明a-SMA、鈣黏蛋白、波形蛋白的表達還可促使上皮細胞-間充質(zhì)（ epithelial-mesenchymal transition, EMT）改變[12]，而EMT能夠通過特定程序?qū)⑸掀ぜ毎D(zhuǎn)

8、化為具有間質(zhì)表型的細胞，如使細胞失去極性、獲得較高的降解細胞外基質(zhì)的能力等，EMT主要參與生長發(fā)育、損傷修復(fù)、腫瘤轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展過程[13]，以細胞黏附分子表達的減少，細胞骨架中波形蛋白（Vimentin）、平滑肌蛋白表達增加以及形態(tài)上具有間充質(zhì)細胞的特征等為主要特點[14-15]，是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移能力的重要生物學(xué)過程[16-17]?？傊?SAM通過細胞骨架重塑，構(gòu)成微絲和EMT的發(fā)生影響細胞遷移

9、，是增強肝癌細胞運動能力的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在肝癌細胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。近年來，研究者對細胞核骨架的研究取得很大進展，成為細胞生物學(xué)研究的一個新的生長點，細胞核骨架是相對于細胞質(zhì)骨架而言，兩者共同構(gòu)成細胞骨架，核骨架與DNA的復(fù)制、RNA的轉(zhuǎn)錄和加工、染色體的組裝密切相關(guān)。肌動蛋白存在于細胞核中已被證明，可能的原因之一是由胞質(zhì)肌動蛋白轉(zhuǎn)運至細胞核，雖然肌動蛋白是眾所周知的在細胞骨架的動態(tài)行為中發(fā)揮職能，但新興的研究在強調(diào)肌動蛋白的新角色，

10、一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肌動蛋白在細胞核活動中的功能，肌動蛋白作為核部件之一，有它自己的結(jié)構(gòu)和功能的規(guī)則，比如與核基質(zhì)，染色質(zhì)重塑，轉(zhuǎn)錄和mRNA加工相關(guān)[18]。因此，α-SAM似乎參與核轉(zhuǎn)錄調(diào)控，可能對細胞增殖產(chǎn)生影響。
　　本次研究采用過表達和siRNA干擾技術(shù)通過UC001kfo調(diào)控α-SMA的表達，使細胞骨架形態(tài)發(fā)生改變，促進肝癌細胞的轉(zhuǎn)移，同時使肝癌細胞發(fā)生 EMT；研究UC001kfo對肝癌細胞增殖和凋亡的調(diào)控效應(yīng)。

11、　　目的:
　　1．采用lncRNA過表達和siRNA干擾技術(shù)通過UC001kfo調(diào)控α-SMA的表達，使細胞骨架形態(tài)發(fā)生改變，探討該基因?qū)Ω伟┘毎忠u轉(zhuǎn)移的影響。
　　2．探討UC001kfo對肝癌細胞增殖的影響。
　　3．探討UC001kfo對肝癌細胞凋亡的影響。
　　方法:
　　以肝癌細胞株HepG2為細胞模型，在37℃5%CO2滅菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，適時傳代；實驗分組為上調(diào)實驗：pCDNA3.1-UC0

12、01kfo（實驗組）、pCDNA3.1（陰性對照組）、HepG2（空白組）；下調(diào)實驗：UC001kfo-siRNA（實驗組）、NC-siRNA（陰性對照組）、HepG2（空白組），每組三個復(fù)孔；pCDNA3.1-UC001kfo載體前期實驗已構(gòu)建；采用脂質(zhì)體（參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書）轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染后進行如下實驗：
　　熒光拍照檢測NC-siRNA-FAM的轉(zhuǎn)染；RT-qpCR檢測UC001kfo和α-S

13、MA的表達；免疫組化檢測細胞骨架的變化；Transwell小室實驗，細胞劃痕實驗檢測細胞侵襲遷移能力；MTT和細胞克隆形成實驗檢測對細胞增殖能力的影響；流式細胞術(shù)檢測對細胞凋亡的影響。
　　統(tǒng)計學(xué)方法:
　　應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，兩組定量資料比較采用t檢驗。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1、 RT-qPCR檢測UC001kfo和SMA的表達量

14、r>　?。?）UC001kfo：48h后 UC001kfo表達量 UC001kfo-pCDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為1924.14±238.69、1.87±0.43、1.00±0.29、0.01±0.00、0.85±0.25。（2）α-SMA：48h后α-SMA表達量 UC001kfo-pCDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-siR

15、NA組分別為6.81±1.39、0.82±0.14、1.00±0.54、0.59±0.04、1.47±0.15。T-test結(jié)果：上調(diào)實驗（1）UC001kfo：48h后UC001kfo表達量UC001kfo-pCDNA組與pCDNA組和HepG2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。（2）α-SMA：48h后α-SMA表達量UC001kfo-pCDNA組與pCDNA組和HepG2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05)。下調(diào)實

16、驗（1）UC001kfo：hUC001kfo-siRNA組與NC-siRNA組和HepG2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（2）α-SMA：UC001kfo-siRNA組與NC-siRNA組和HepG2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。
　　2、免疫組化IA值
　　48hUC001kfo-pCDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為972.53±59.

17、10、623.11±57.66、697.98±51.29、399.03±64.47、633.94±44.44。T-test結(jié)果：上調(diào)實驗：UC001kfo-pCDNA組與pCDNA組和HepG2組比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01)；下調(diào)實驗：UC001kfo-siRNA組與NC-siRNA組和HepG2組比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　3、Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力的變化
　　轉(zhuǎn)

18、染48h后UC001kfo-pCDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為213±16.17、96±4.58、128±3.21、28±9.64、80±4.04；轉(zhuǎn)染96h后UC001kfo-pCDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為201±19.09、97±5.69、116±11.53、40±3.79、72±10.21。T-tes

19、t結(jié)果：上調(diào)實驗：轉(zhuǎn)染48h后UC001kfo-pCDNA組分別與pCDNA組和HepG2組比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；轉(zhuǎn)染96h后UC001kfo-pCDNA組分別與pCDNA組和HepG2組比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。下調(diào)實驗：轉(zhuǎn)染48h后UC001kfo-siRNA組分別與NC-siRNA組和HepG2組比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；轉(zhuǎn)染96h后UC001kfo-siRNA組分別

20、與NC-siRNA組和HepG2組比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　4、細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力的變化
　　轉(zhuǎn)染48h后距劃痕24h：遷移率（%）UC001kfo-pCDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為32.56±5.56、31.05±7.12、35.77±7.28、25.72±5.13、32.59±3.74；距劃痕48h：UC001kfo-p

21、CDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為63.57±5.58、63.41±6.04、56.77±7.54、40.76±4.74、54.76±0.57；
　　距劃痕72h：UC001kfo-pCDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為98.34±2.88、87.90±0.83、92.43±2.19、、60.98±1.41、8

22、0.34±1.05。T-test
　　結(jié)果：上調(diào)實驗：轉(zhuǎn)染48h后距劃痕24hUC001kfo-pCDNA組分別與 HepG2組和 pCDNA組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＞0.05）；距劃痕48hUC001kfo-pCDNA組與HepG2組和pCDNA組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；距劃痕72h UC001kfo-pCDNA組與HepG2組和pCDNA組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。下調(diào)實驗：距劃痕24hUC00

23、1kfo-siRNA組分別與HepG2組和 NC-siRNA組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＞0.05）；距劃痕48hUC001kfo-siRNA組與HepG2組和NC-siRNA組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；距劃痕72hUC001kfo-siRNA組與HepG2組和NC-siRNA組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。
　　5、 MTT和克隆形成實驗檢測細胞增殖能力的變化
　　1．MTT法檢測結(jié)果顯示：24h時

24、pcDNA3.1-UC001kfo組、HepG2組、pCDNA組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為0.72±0.02、0.67±0.04、0.71±0.02、0.56±0.04、0.7±0.02；48h時 pCDNA-UC001kfo組、HepG2組、pCDNA組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為1.22±0.07、1.03±0.03、1.09±0.04、0.8±0.03、0.97±0.0

25、7；96h時 pCDNA-UC001kfo組、HepG2組、pCDNA組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為1.63±0.07、1.39±0.07、1.47±0.03、1.05±0.04、1.38±0.02。T-test結(jié)果：上調(diào)實驗：24hUC001kfo-pCDNA組分別與HepG2組和 pCDNA組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＞0.05）；48h時UC001kfo-pCDNA組與 pCDNA比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義

26、（ P＜0.05）， UC001kfo-pCDNA組與HepG2組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；96h時 UC001kfo-pCDNA組與 pCDNA比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P＜0.05）；UC001kfo-pCDNA組與HepG2組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；下調(diào)實驗：24hUC001kfo-siRNA組分別與HepG2組和NC-siRNA組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；48h UC001kfo-si

27、RNA組與NC-siRNA組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；UC001kfo-siRNA組與HepG2組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。96hUC001kfo-siRNA組與NC-siRNA組和HepG2組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　2．平板克隆形成實驗結(jié)果顯示：48h時克隆集落形成率（%） pCDNA-UC001kfo組、HepG2組、pCDNA組、UC001kfo-siRNA組、NC-si

28、RNA組分別為34.94±4.24、25.73±2.32、26.80±1.91、13.20±0.92、24.40±2.31；96h時pCDNA-UC001kfo組、HepG2組、pCDNA組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為40.93±4.41、30.40±5.14、25.80±3.67、13.60±1.83、22.73±1.62。
　　T-test結(jié)果：上調(diào)實驗：48h時UC001kfo-pCDNA組與p

29、CDNA組和HepG2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。96h時UC001kfo-pCDNA組與pCDNA組和 HepG2組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.01）；下調(diào)實驗：48h UC001kfo-siRNA組與 NC-siRNA組和HepG2組比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；96hUC001kfo-siRNA組與NC-siRNA組和HepG2組比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　6

30、、流式細胞儀檢測凋亡變化
　　轉(zhuǎn)染48h后HepG2組、pCDNA-UC001kfo組、pCDNA組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為3.5±2.36、6.3±1.15、3.7±2.76、3.83±2.46、3.53±2.28，轉(zhuǎn)染96h后HepG2組、pCDNA-UC001kfo組、pCDNA組、UC001kfo-siRNA組、NC-siRNA組分別為3.12±0.58、4.97±1.16、4.03±1.

31、04、2.3±0.56、3.6±1.78。T-test結(jié)果：上調(diào)實驗：48h、96h pCDNA-UC001kfo組分別與pCDNA組、HepG2組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；下調(diào)實驗：48h、96h pCDNA-siRNA組分別與siRNA組、HepG2組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．UC001kfo通過調(diào)控a-SMA促進肝癌細胞偽足形成，細胞骨架增多，更易于肝癌細胞的運動，