黃瓜果實(shí)彎曲相關(guān)基因Cs14-3-3的克隆及對(duì)擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、黃瓜(Cucumis sativus L.)是我國(guó)保護(hù)地栽培的重要蔬菜品種。果形是黃瓜重要的外觀品質(zhì)之一，果實(shí)彎曲嚴(yán)重影響了黃瓜外觀品質(zhì)，使黃瓜商品性顯著下降，從而給農(nóng)民造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，探究黃瓜果實(shí)彎曲的機(jī)理從而減少?gòu)澢麑?shí)的比率在黃瓜育種及生產(chǎn)過程中至關(guān)重要。
　　 14-3-3蛋白是一類普遍存在于真核生物中高度保守的調(diào)節(jié)蛋白，它通過與靶蛋白的相互作用，參與生物體內(nèi)的基本代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂、光周期、生物脅迫、非

2、生物脅迫等多種調(diào)控過程，是生物體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)蛋白。實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果表明，14-3-3蛋白為彎曲黃瓜品種長(zhǎng)春密刺果實(shí)腹部和果實(shí)脊部的差異表達(dá)蛋白，此蛋白在彎曲果實(shí)腹部的表達(dá)量顯著高于彎曲果實(shí)的脊部，且編碼此蛋白的核苷酸序列與黃瓜果實(shí)彎曲緊密連鎖的分子標(biāo)記位于同一染色體上，這暗示著14-3-3蛋白基因可能在黃瓜果實(shí)彎曲過程中發(fā)揮著重要作用。
　　 本研究以黃瓜果實(shí)彎曲品種長(zhǎng)春密刺為試驗(yàn)材料，通過RT-PCR方法分離并克隆了黃瓜果

3、皮14-3-3蛋白基因，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)順直果實(shí)和彎曲果實(shí)腹部及脊部在果實(shí)開花的2、4、6、8、10、12天的基因表達(dá)量進(jìn)行了研究。構(gòu)建了植物過表達(dá)載體和RNA干擾載體，通過花序侵染法對(duì)擬南芥進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，希望能為揭示黃瓜果實(shí)彎曲的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)克隆了黃瓜果皮14-3-3蛋白基因，并將此基因命名為Cs14-3-3。Cs14-3-3基因cDNA全長(zhǎng)792bp，編碼263個(gè)氨基酸，

4、氨基酸序列含有14-3-3蛋白保守結(jié)構(gòu)域，屬于14-3-3超級(jí)家族。基因序列同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，黃瓜與葡萄的基因序列同源性最高為86％，與橡膠樹、木薯、大黃、煙草、擬南芥同源性分別達(dá)到80％以上。氨基酸序列同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，黃瓜與橡膠樹、木薯、龍眼、擬南芥的相似性最高，均達(dá)到90％以上。分子進(jìn)化樹顯示，黃瓜與葡萄、橡膠樹、木薯和歐洲山毛櫸處于同一個(gè)進(jìn)化支上，親緣關(guān)系最近。Cs14-3-3基因編碼蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定親水蛋白，不具有跨膜結(jié)構(gòu)，含有一

5、個(gè)14-3-3蛋白信號(hào)序列Ⅰ位點(diǎn)，一個(gè)14-3-3蛋白信號(hào)序列Ⅱ位點(diǎn)，多個(gè)磷酸化位點(diǎn)、?；稽c(diǎn)和糖基化位點(diǎn)。主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。
　　 (2)對(duì)Cs14-3-3基因在黃瓜順直果實(shí)和彎曲果實(shí)腹部及脊部在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行的分析結(jié)果表明，無論是順直果實(shí)還是彎曲果實(shí)的腹部或脊部，Cs14-3-3在果實(shí)開花2天的表達(dá)量明顯高于開花后其他時(shí)期，從果實(shí)開花4天到12天，隨著果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育，Cs14-3-3基因的表達(dá)量在

6、一定范圍內(nèi)浮動(dòng)，無明顯的增加或減少趨勢(shì)。在果實(shí)發(fā)育的不同時(shí)期，Cs14-3-3基因在順直果實(shí)和彎曲果實(shí)腹部及脊部的表達(dá)量均呈現(xiàn)彎曲果實(shí)腹部＞順直果實(shí)＞彎曲果實(shí)脊部的趨勢(shì)。說明Cs14-3-3基因與黃瓜果實(shí)彎曲有關(guān)，為黃瓜果實(shí)彎曲相關(guān)基因，且此基因在黃瓜果實(shí)開花早期發(fā)育過程中起重要作用。
　　 (3)構(gòu)建了Cs14-3-3基因過表達(dá)載體，命名為PBI121-M14-3-3;構(gòu)建了Cs14-3-3基因RNA干擾載體，命名為PBI12