從NF-κB-Jmjd3信號軸下游基因表達的表觀調(diào)控角度分析衰老血清損傷人血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的研究.pdf

1、目的：
　　通過將老年人血清作用臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞后，觀察衰老機體血清對血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)活性的影響；研究衰老機體血清對內(nèi)皮細(xì)胞的炎性介質(zhì)分泌的作用；了解調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞炎性介質(zhì)的NF-κB-Jmjd3信號通路的活化情況，分析其可能的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制。期望對與衰老相關(guān)性疾病的診斷及治療提供新思路和新靶點。
　　方法：
　　1、研究對象的選擇及分組：
　　青年組：20~30歲健康體檢者16例，平均年齡（25.60±1

2、.97）歲；老年組：60~70歲健康體檢者16例，平均年齡（66.60±4.78）歲；高齡老年組16例：80歲以上健康老年人，平均年齡（85.86±5.79）歲。
　　取清晨空腹靜脈血5ml，離心后分離血清分裝后放入-80℃冰箱冷凍待用。實驗時，將冷凍收集好的血清按健康青年組（25y）、健康老年組（65y）、健康高齡老年組（85y）分別混合制成3個標(biāo)本池。
　　2、臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的分離、培養(yǎng)、復(fù)蘇、傳代、

3、鑒定：取傳代至3~5代的細(xì)胞于對數(shù)生長期進行實驗，隨機分組為25y，65y和85y組，分別以健康青年組、健康老年組和健康高齡老年樣本池中的血清配成條件培養(yǎng)基作用HUVECs細(xì)胞；根據(jù)檢測需要分別在不同時間點收集細(xì)胞和血清樣本，進行相應(yīng)的測定，每個實驗重復(fù)3次。
　　3、細(xì)胞活性分析：采用CCK8法檢測各組血清處理對HUVECs活性的影響。
　　4、細(xì)胞衰老情況分析：β-半乳糖苷酶染色試劑盒計數(shù)各組內(nèi)皮細(xì)胞中衰老細(xì)胞的數(shù)量。<

4、br>　　5、細(xì)胞周期分析：采用流式細(xì)胞術(shù)分析各組血清誘導(dǎo)對HUVECs細(xì)胞周期的影響。
　　6、活性氧水平分析：采用 DCFH-DA探針法，運用流式細(xì)胞術(shù)檢測內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。
　　7、血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)能力分析：各研究組血清誘導(dǎo)HUVECs后，用劃痕實驗檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞劃痕后的修復(fù)能力。
　　8、液相芯片技術(shù)分析血清池中炎性介質(zhì)蛋白的水平。
　　9、血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和功能效應(yīng)分子表達水平：運用熒光實

5、時定量PCR( qRT-PCR)測定內(nèi)皮細(xì)胞炎性介質(zhì)和粘附分子的表達（IL-1β, IL-6, TNF-а, IL-12, TGF-β, VCAM, ICAM, eNOS）。
　　10、血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)調(diào)控上述炎性介質(zhì)和粘附分子表達的NF-κB/p65-Jmjd3信號通路活性分析：采用免疫熒光染色技術(shù)觀察各組血清誘導(dǎo)HUVECs后，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的NF-κB/p65核表達變化，Jmjd3的表達變化，組蛋白H3K27中賴氨酸甲基化水平的變

6、化。
　　結(jié)果：
　　1、不同血清處理HUVECs后，細(xì)胞活性的改變情況：與青年組(25y)相比，老年組(65y)、高齡老年組（85y）血清誘導(dǎo)后的均出現(xiàn)了生長抑制現(xiàn)象，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，分別為P＜0.05、P＜0.01。
　　2、血清誘導(dǎo)細(xì)胞衰老情況：與青年組相比，老年組血清誘導(dǎo)HUVECs后， HUVECs中β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加、P＜0.05；與青年組相比，高齡老年組血清誘導(dǎo)的HUVECs中β-半乳

7、糖苷酶染色陽性細(xì)胞數(shù)亦顯著增多、P＜0.0001。
　　3、各組血清處理對HUVECs周期的影響：與25y組相比，65y組S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)減少，而85y組S期細(xì)胞數(shù)增多，推測隨著年齡的增加，血清誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期紊亂，老年組S期細(xì)胞減少而高齡老年組S期細(xì)胞百分比異常增高。
　　4、不同血清誘導(dǎo)HUVECs氧化應(yīng)激情況的分析：65y組內(nèi)皮細(xì)胞探針的平均熒光強度較25y組顯著增高， P＜0.0001；85y的平均熒光強度亦顯著

8、增高，與25y相比， P＜0.0001。
　　5、血清對HUVECs的修復(fù)能力的影響：經(jīng)過24小時觀察，65y和85y組HUVECs均展現(xiàn)出明顯降低的遷移修復(fù)能力。
　　6、血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)調(diào)控上述炎性介質(zhì)和粘附分子表達的NF-κB/p65-Jmjd3信號通路活性：各研究組血清誘導(dǎo)HUVECs2小時后，與青年組(25y)相比，老年組(65y)及高齡老年組（85y）整體熒光強度逐漸增強，NF-κB/p65表達上調(diào)、并逐漸向轉(zhuǎn)胞核

9、內(nèi)聚集；Jmjd3整體熒光強度逐漸增強，表達上調(diào)；內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)H3K27me3表達下調(diào)、整體熒光強度逐漸減弱；內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)H3K27me2表達上調(diào)、整體熒光強度逐漸增強。
　　7、各組血清池中炎性介質(zhì)蛋白水平：與青年組(25y)相比，老年組(65y) TNF-α、IL-12、IL-6、IL-1β蛋白水平高表達，高齡老年組(85y)上述炎性介質(zhì)低水平表達。
　　8、血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和功能效應(yīng)分子表達：各組血清誘導(dǎo)HUVECs2

10、4小時后，與青年組(25y)相比，老年組(65y) TNF-α、白介素-12（IL-12）、VCAM-1基因mRNA的表達水平顯著上調(diào)，P＜0.01、P＜0.001、P＜0.001；eNOS表達水平明顯下調(diào)，P＜0.001；IL-6、IL-1β基因mRNA的表達水平顯著下調(diào)，P＜0.0001、P＜0.0001；高齡老年組(85y) IL-6、IL-1β、TGF-β、eNOS基因mRNA的表達水平顯著下調(diào)，P＜0.0001、P＜0.000

11、1、P＜0.005、P＜0.0001。
　　結(jié)論：
　　隨著年齡增加，衰老機體血清抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞活性，并顯著促進內(nèi)皮細(xì)胞衰老；導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞周期紊亂；阻礙內(nèi)皮細(xì)胞傷口的修復(fù)能力；同時，HUVECs的氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯增強；HUVECs的炎性介質(zhì)及粘附分子的基因表達水平出現(xiàn)異常，這些現(xiàn)象伴隨NF-κB/p65-Jmjd3信號通路的異常活化和H3K27甲基化水平的下調(diào)。NF-κB/p65-Jmjd3信號通路參與了衰老機體血清誘導(dǎo)內(nèi)