東莨菪堿對(duì)斜角帶核膽堿能神經(jīng)元損傷大鼠抑郁樣行為的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：抑郁癥的發(fā)生與膽堿能系統(tǒng)的異常緊密相關(guān)。長(zhǎng)期以來(lái)不斷有研究人員嘗試通過(guò)改變膽堿能系統(tǒng)活動(dòng)來(lái)逆轉(zhuǎn)人或動(dòng)物的抑郁癥狀。國(guó)內(nèi)外研究已經(jīng)證實(shí)膽堿能神經(jīng)元損傷會(huì)損害認(rèn)知功能，并伴有抑郁樣行為。而最近的研究發(fā)現(xiàn)，在抑郁癥患者中靜注毒蕈堿型乙酰膽堿受體拮抗劑東莨菪堿4.0μg/kg可以發(fā)揮快速、強(qiáng)勁且持續(xù)的抗抑郁作用，但東莨菪堿抗抑郁的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。本研究通過(guò)特異性毀損大鼠斜角帶核膽堿能神經(jīng)元，誘導(dǎo)抑郁樣行為，觀察東莨菪堿對(duì)斜角帶核膽

2、堿能神經(jīng)元損傷大鼠抑郁樣行為的作用，以期闡明東莨菪堿與抑郁癥之間相互作用的中樞位點(diǎn)及神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)一：特異性毀損斜角帶核膽堿能神經(jīng)元對(duì)大鼠抑郁樣行為的影響
　　方法：成年雄性 SD大鼠隨機(jī)分成三組：空白對(duì)照組（Control，n=6），假手術(shù)組（SHAM，n=6），神經(jīng)免疫毒素皂草素（192IgG-Saporin）組（192IgG，n=6）。 SHAM組和192IgG組大鼠立體定位，分別在斜角帶核（AP:+0.4

3、8mm,ML:±0.8mm,DV:-8.0mm）微注射0.5μl/側(cè)核團(tuán)的PBS和0.5μg/μl192IgG-Saporin，2周后所有大鼠進(jìn)行糖水偏好（Sucrose preference test，SPT）、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT）、自發(fā)活動(dòng)（locomotor activity）、強(qiáng)迫游泳（forced swimming test，F(xiàn)ST），最后處死大鼠取腦組織進(jìn)行 H&E染色，并通過(guò)免疫熒光染色（im

4、munofluorescence，IF）檢測(cè) ChAt陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
　　結(jié)果：H&E染色顯示，與 SHAM組相比，192IgG組在海馬中細(xì)胞數(shù)層數(shù)減少，同樣 IF結(jié)果顯示192IgG組斜角帶核中的ChAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著降低（P<0.01）。行為學(xué) SPT、OFT、FST和 Locomotor activity測(cè)試中發(fā)現(xiàn)，特異性毀損斜角帶核膽堿能神經(jīng)元能顯著降低大鼠對(duì)糖水的偏好（P<0.05），延長(zhǎng)大鼠強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間（P<0.0

5、1），并顯著減少大鼠的活動(dòng)度（P<0.01），而SHAM組與 Control組大鼠則無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明特異性毀損斜角帶核膽堿能神經(jīng)元會(huì)使大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為。
　　實(shí)驗(yàn)二：東莨菪堿對(duì)斜角帶核膽堿能神經(jīng)元損傷大鼠抑郁樣行為的影響
　　方法：成年雄性 SD大鼠隨機(jī)分成四組：假手術(shù)組（SHAM，n=6），生理鹽水對(duì)照組（Vehicle，n=6），東莨菪堿25μg/kg組（Scopolamine25μg/kg，n=6），東莨菪堿5

6、0μg/kg組（Scopolamine50μg/kg，n=6）。SHAM組和其余組大鼠立體定位，分別在斜角帶核微注射0.5μl/側(cè)核團(tuán)的PBS和0.5μg/μl192IgG-Saporin。2周后，除 SHAM組大鼠外，其余組分別在每次測(cè)試前1小時(shí)腹腔注射生理鹽水和東莨菪堿（25μg/kg及50μg/kg），然后所有大鼠在第16、18、20、22及24天依次進(jìn)行 SPT、OFT、EMP、Locomotor activity和 FST。行

7、為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠取腦組織進(jìn)行 Nissl染色，IHC檢測(cè) BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及Western blot檢測(cè) pERK、 ERK、pCREB、CREB、BDNF、pAKT和 AKT蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1、行為學(xué)測(cè)試：根據(jù)糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與 Vehicle組相比，25μg/kg東莨菪堿處理組大鼠對(duì)糖水的偏好明顯增加（P<0.01）;在 OFT中，4組大鼠的穿線次數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但25μg/k g東莨菪堿處

8、理組大鼠的直立次數(shù)顯著高于 Vehicle組（P<0.05）；在 EMP中，斜角帶核膽堿能神經(jīng)元損傷的3組大鼠開(kāi)放臂停留時(shí)間百分比之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；在Locomotor activity中，25μg/kg東莨菪堿處理組大鼠的活動(dòng)距離均較 Vehicle組明顯增加（P<0.05）；在 FST中，25μg/kg東莨菪堿處理組大鼠的不動(dòng)時(shí)間百分比均較 Vehicle組縮短（P<0.01）；所有測(cè)試中50μg/kg東莨菪堿處

9、理組大鼠與Vehicle組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2、Nissl染色：25μg/kg東莨菪堿處理組大鼠海馬細(xì)胞層數(shù)多于 Vehicle組。
　　3、IHC：與 Vehicle組相比，25μg/kg東莨菪堿處理組大鼠海馬 CA3區(qū)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（B D N F）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05）。
　　4、Western blot：與 Vehicle組相比，25μg/kg東莨菪堿能明顯增加斜角帶核膽

10、堿能神經(jīng)損傷大鼠海馬 pERK、pCREB、BDNF及 pAKT蛋白表達(dá)（P<0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)三：東莨菪堿及選擇性 M1受體拮抗劑對(duì)斜角帶核膽堿能神經(jīng)元損傷大鼠抑郁樣行為的影響
　　方法：成年雄性 SD大鼠隨機(jī)分成五組：假手術(shù)組（SHAM，n=6），生理鹽水對(duì)照組（Vehicle，n=6），東莨菪堿組（Scopolamine，n=6），替侖西平組（Telezepine，n=6），比哌立登組（Biperiden，n=6）

11、。SHAM組和其余組大鼠立體定位，分別在斜角帶核微注射0.5μl/側(cè)核團(tuán)的PBS和0.5μg/μl192IgG-Saporin。2周后，除 SHAM組大鼠外，其余組分別在每次測(cè)試前1小時(shí)腹腔注射生理鹽水、東莨菪堿25μg/kg和比哌立登1mg/kg，皮下注射替侖西平3mg/kg，然后所有大鼠在第16、18、20、22及24天依次進(jìn)行 SPT、OFT、EMP、Locomotor activity和 FST。行為學(xué)結(jié)束后處死大鼠取腦組織進(jìn)行

12、 Western blot檢測(cè) pERK、ERK、pCREB、CREB、BDNF、pAKT及 AKT蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1、行為學(xué)測(cè)試：根據(jù) FST結(jié)果，與 Vehicle組相比，東莨菪堿組、替侖西平組和比哌立登組大鼠對(duì)糖水的偏好明顯增加（P<0.01）;在 OFT中，5組大鼠的穿線次數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但東莨菪堿組和比哌立登組大鼠的直立次數(shù)顯著高于 Vehicle組（P<0.05）；在 EMP中，5組大鼠開(kāi)放臂

13、停留時(shí)間百分比之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；在 Locomotor activity中，5組大鼠的活動(dòng)距離無(wú)顯著性差異（P<0.05）；在 F S T中，東莨菪堿組、替侖西平組和比哌立登組大鼠的不動(dòng)時(shí)間百分比均較 Vehicle組縮短（P<0.001，P<0.05，P<0.01）。
　　2、Western blot：與 Vehicle組相比，東莨菪堿、替侖西平和比哌立登能明顯增加斜角帶核膽堿能神經(jīng)元損傷大鼠海馬 pERK、

14、pCREB、BDNF及 pAKT蛋白表達(dá)（P<0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)四：東莨菪堿對(duì)斜角帶核膽堿能神經(jīng)元損傷大鼠海馬齒狀回5-HIAA釋放的影響
　　方法：成年雄性 SD大鼠隨機(jī)分成五組：空白對(duì)照組（Control，n=15），生理鹽水對(duì)照組（Vehicle，n=3），東莨菪堿組（Scopolamine，n=3），替侖西平組（Telezepine，n=3），比哌立登組（Biperiden，n=3），氯胺酮組（Ketamine，

15、n=3）,丁螺環(huán)酮組（buspirone，n=3），Control組和其余組大鼠立體定位，分別在斜角帶核微注射0.5μl/側(cè)核團(tuán)的PBS和0.5μg/μl192IgG-Saporin。2周后所有大鼠以海馬齒狀回（DG）（AP-3.8mm,ML-1.6mm,DV-2.0mm）為靶點(diǎn)埋置微透析探針套管?；謴?fù)7天，通過(guò)套管植入微透析探針。人工腦脊液(aCSF145 mM NaCl,2.8 mM KCl,1.2 mM MgCl2,1.2 mMC

16、aCl2,5.4 mM glucose，pH7.2)以1μl/min的流速灌流，高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)5-HIAA含量。2小時(shí)后，分別腹腔注射生理鹽水、東莨菪堿25μg/kg、比哌立登1mg/kg、氯胺酮10mg/kg和丁螺環(huán)酮10mg/kg，皮下注射替侖西平3mg/kg。Control組各取3只與給藥組同等給藥，Vehicle組注射等量生理鹽水。
　　結(jié)果：與 Vehicle組相比，東莨菪堿、替侖西平、比哌立登和氯胺酮能明

17、顯增加斜角帶核膽堿能神經(jīng)元損傷大鼠海馬 DG5-HIAA的釋放（P<0.05），而除氯胺酮外，均不能顯著改變大鼠海馬 DG5-HIAA的釋放（P＞0.05），氯胺酮能顯著增加正常大鼠海馬 DG5-HIAA的釋放（P<0.01），丁螺環(huán)酮對(duì)斜角帶核膽堿能神經(jīng)元損傷大鼠和正常大鼠海馬 D G5-H I A A釋放無(wú)影響（P＞0.05）。
　　結(jié)論：本研究證實(shí)特異性毀損斜角帶核膽堿能神經(jīng)元顯著誘導(dǎo)大鼠抑郁樣行為，而這種抑郁樣行為可被東莨

18、菪堿和選擇性 M1受體拮抗劑所逆轉(zhuǎn)，表明東莨菪堿能改善斜角帶核膽堿能神經(jīng)元損傷大鼠抑郁樣行為及潛在的抗抑郁機(jī)制可能是通過(guò)抑制突觸后 M1受體，進(jìn)而激活 ERK/CREB/BDNF通路，增加BDNF的釋放，改善抑郁情緒。此外，結(jié)果還顯示東莨菪堿、選擇性 M1受體拮抗劑與快速起效抗抑郁藥氯胺酮，均能增加斜角帶核膽堿能神經(jīng)元損傷大鼠海馬齒狀回5-HIAA的釋放，間接提示5-HT釋放增多，可能是東莨菪堿與氯胺酮抗抑郁作用潛在機(jī)制之一，對(duì)快速起效