PD-1對小鼠體內免疫反應的調節(jié)在動脈粥樣硬化形成中的作用.pdf

1、目的：目前，動脈粥樣硬化在我國的患病率和發(fā)病率呈顯著上升趨勢，并已成為我國老年人的主要病死原因之一。最近的研究表明，炎癥及免疫反應在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。免疫細胞，特別是炎性細胞的浸潤、激活及增殖在易損性動脈粥樣硬化斑塊的形成和進展中發(fā)揮著極為重要的作用。細胞程序性死亡受體1（PD-1）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種介導免疫抑制信號的共刺激分子受體，在激活的T細胞、B細胞和一些髓樣細胞上表達。近年來，人們發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-Ls路

2、徑與急慢性炎癥、腫瘤、免疫耐受、自身免疫性疾病等密切相關。因為動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展與免疫及炎癥反應有著密切的聯(lián)系，所以PD-1及其通路可能對動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮了重要調控作用。因此本研究旨在利用PD-1和ApoE雙基因缺陷小鼠，來研究PD-1信號通路在動脈粥樣硬化發(fā)展中的作用。
　　方法：將PD-1-/-小鼠和 ApoE-/-小鼠進行交配，獲得 PD-1-/-ApoE-/-雙基因敲除小鼠。以同齡野生型PD-1+/+ApoE

3、-/-小鼠作為對照組，分別測定6周時小鼠體重、血清三酰甘油、總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇的基線水平。兩組小鼠在高脂喂養(yǎng)12周后，再次檢測其體重、血清三酰甘油、總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇的水平。小鼠麻醉后，打開胸腔，用注射器穿刺左心室，用冷磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗左心腔和主動脈腔內的殘余血液。自升主動脈處分離心臟與主動脈，并切除心臟下半部分，心臟上半部分用冷PBS沖洗殘血后，包埋于OCT。鈍性分離自主動脈弓至腹主動脈分叉處的主動脈節(jié)段

4、，用冷 PBS沖洗殘血后，取標本進行分析。用油紅染色法觀察標本動脈粥樣硬化情況。同時，利用免疫組化方法分析斑塊內CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞數(shù)量或比例變化。利用流式細胞儀檢測脾細胞總數(shù)、CD4+T細胞、CD8+T細胞及細胞表面 CD26L、CD25的表達水平。利用細胞純化柱純化 CD4+和 CD8+T細胞用CFSE標記，從正常小鼠分離樹突狀細胞和巨噬細胞，經LDL處理后，按不同比例與CD4+和CD

5、8+T細胞混合，經FACS檢測確定CD4+和CD8+T細胞的增殖情況。將純化后的CD4+和CD8+T細胞經抗CD3抗體激活，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測上清中IL-2、IFN-γ、TNF-α的含量。同時，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測高脂喂養(yǎng)12周后小鼠空腹血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α的水平。
　　結果：6周基線和高脂喂養(yǎng)12周末，實驗組和對照組小鼠的體重、血清三酰甘油、總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇水平均無顯著性差異；高脂喂養(yǎng)12周后，

6、PD-1-/-ApoE-/-小鼠主動脈弓和降主動脈內膜內動脈粥樣硬化斑塊較對照組顯著增多，管腔嚴重狹窄，主動脈根部切片顯示動脈粥樣硬化斑塊面積是對照組的約2倍[（0.51±0.08）mm2 vs（0.29±0.06）mm2，P＜0.001]。免疫組織化學分析顯示，12周高脂喂養(yǎng)后，實驗組斑塊內 CD3+T淋巴細胞含量為（154.88±36.64）個/mm2，較對照組的（59.38±25.28）個/mm2顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義（t=2

7、.14， P<0.01）。進一步分析斑塊內細胞的組成顯示，PD-1-/-ApoE-/-實驗組斑塊內CD4+T淋巴細胞的數(shù)量是對照組的約3倍，CD8+T淋巴細胞也較對照組明顯增加。巨噬細胞的數(shù)量在PD-1-/-ApoE-/-實驗組斑塊中也有增多，但平滑肌細胞的數(shù)量則在兩組中無顯著性差異。實驗組脾臟中細胞總數(shù)、CD4+、CD8+T細胞的數(shù)量顯著增多，其中CD3+CD62L-、CD3+CD25+細胞的表達也顯著增高。而且，實驗組T細胞經CD3

8、抗體激活后分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α能力顯著增強。當T細胞與巨噬細胞或樹突狀細胞共孵后，其增殖能力較對照組更強。12周高脂喂養(yǎng)后，實驗組小鼠血清中TNF-α的水平較對照組顯著增高，而IL-2、IFN-γ的濃度無顯著差異。
　　結論：本研究通過觀察PD-1-/-ApoE-/-雙基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的加速進展、斑塊內細胞成分的變化以及T細胞功能的改變，提示了在激活的T細胞中PD-1/PD-Ls信號通路下調參與了動脈粥樣硬