哺乳動物DNA聚合酶δ的結(jié)構(gòu)及其結(jié)合蛋白PDIP38的功能研究.pdf

1、該論文對哺乳動物pol δ的結(jié)構(gòu)、亞基組成以及pol δ結(jié)合蛋白PDIP38的功能進行了研究.我們采用該實驗室獨有的pol δ p125單克隆抗體免疫親和層析柱,再結(jié)合其它傳統(tǒng)層析方法來分離純化牛胸腺和Hela細胞的pol δ,通過Superose 6分子篩層析、甘油梯度離心的方法來研究pol δ的亞基組成;通過不同的重組病毒感染真核細胞以構(gòu)建不同亞基組成的pol δ的方法來研究pol δ的p12亞基的功能;采用不同的鹽濃度來洗脫與p1

2、25單克隆抗體免疫親和層析柱結(jié)合的蛋白質(zhì),看是否能從pol δ復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)一些令人感興趣的未知的pol δ結(jié)合蛋白.在對PDIP38功能進行研究時,我們構(gòu)建、表達了重組人GST-PDIP38全長和缺失突變體蛋白,用純化了的重組人GST-PDIP38全長和缺失突變體蛋白、重組人His-PDIP38蛋白和多種天然和重組的po1 δ,通過poly dA oligo dT和poly(dA-dT)assay等方法研究PDIP38對pol δ DN

3、A聚合活性的影響;通過體外GST pull down 實驗確定了PDIP38與po1 δ p125、p50亞基和PCNA的結(jié)合位點;利用重組病毒在昆蟲細胞體內(nèi)構(gòu)建His-PDIP38/p125、His-PDIP38/p50和His-PDIP38/PCNA復(fù)合物,來確定PDIP38與pol δ p125、p50亞基和PCNA在體內(nèi)的結(jié)合情況;此外,還利用免疫熒光染色法觀察PDIP38在細胞內(nèi)的定位,探索PDIP38在細胞內(nèi)的功能.我們的研

4、究達到了預(yù)期的目的,并取得了很多新成果,主要的實驗結(jié)果如下:1.從He1a細胞和小牛胸腺純化得到的pol δ和重組人pol δ一樣,都是異四聚體單聚物,p68可能是影響其遷移率的主要因素.2.以po1y dA·oligo dT和poly(dA-dT)為模板時,重組polδ的三亞基復(fù)合物(p125/p50/p12)和四亞基復(fù)合物(p125/p68/p50/p12)的DNA聚合活性無顯著差異,但另一種組合的三亞基復(fù)合物(p125/p68/p

5、50)的活性則低很多,而且單獨加p12亞基到從小牛胸腺純化的p125/p50復(fù)合物中,可以增加p125/p50核心酶的DNA聚合活性.3.首次發(fā)現(xiàn)Hela細胞內(nèi)的po1 δ可形成兩個具有DNA聚合酶活性的復(fù)合物,PCNA、cdc2/cdkl、Cyclin E等與細胞周期有關(guān)的蛋白及功能未知的PDIP46存在于較低鹽濃度洗脫下來的pol δ復(fù)合物中;參與DNA修復(fù)的Ku70和Ku80蛋白存在于較高鹽濃度洗脫下來的pol δ復(fù)合物中;而p2

6、1蛋白和功能未知的PDIP38在兩個pol δ復(fù)合物里都檢測到.4.首次確認pol δ的p50、p125亞基和PCNA與PDIP38的結(jié)合位點,分別位于PDIP38的C-末端243-368、N-末端1-125和C-末端122-368的氨基酸區(qū)域.而PDIP38與pol δ的p50亞基的結(jié)合位點則在于p50的C-末端252-400的氨基酸區(qū)域.5.首次發(fā)現(xiàn)PDIP38可以抑制天然和重組人pol δ的活性.PDIP38可能通過抑制PCNA和

7、p50而達到抑制pol δ活性的作用.PDIP38經(jīng)PCNA途徑的抑制作用是可逆的,增加PCNA的量可逆轉(zhuǎn)PDIP38對pol δ的抑制;PDIP38經(jīng)p50途徑的抑制作用是不可逆的,增加p50的量不可逆轉(zhuǎn)PDIP38對pol δ的抑制.6.確定了PDIP38 C-末端243-368的氨基酸區(qū)域是PDIP38重要的蛋白質(zhì)結(jié)合和抑制功能區(qū)域.7.首次利用免疫熒光染色法定位了293細胞內(nèi)的PDIP38和pol δ p50亞基,發(fā)現(xiàn)PDIP3