哺乳動物糞便DNA提取技術(shù)研究.pdf

1、以糞便為材料提取動物DNA進(jìn)行保護(hù)遺傳學(xué)和分子生態(tài)學(xué)研究的關(guān)鍵是能否提取到高質(zhì)量的糞便DNA。自糞便DNA分析技術(shù)興起后，國內(nèi)外在這方面做出了巨大的成就，發(fā)展了多種糞便DNA提取方法，充分證實了糞便DNA分析的可行性。但仍存在以下問題：①各種提取方法通用性不好。在許多實驗中存在擴(kuò)增成功率在物種和個體之間的差異。這一直是阻礙糞便DNA提取技術(shù)推廣的主要障礙。雖然專用糞便DNA提取試劑盒有著較好的通用性，但昂貴的價格限制了該試劑盒的廣泛應(yīng)用

2、，因此構(gòu)建一套效果好、通用性好、性價比高的糞便DNA提取方法，可以大大推進(jìn)糞便DNA技術(shù)的推廣。②對陳舊糞便DNA提取的研究還是空白。本文所指的陳舊糞便是保存超過2年以上的糞便樣品。從陳舊糞便中提取DNA對于充分利用遷出或死亡動物的遺傳信息，擴(kuò)大分子糞便學(xué)技術(shù)的應(yīng)用范圍具有十分重要的作用。③對糞便最佳保存方法的摸索。保存方法合適與否對糞便DNA質(zhì)量影響很大，有許多學(xué)者對各種保存方法的保存效果進(jìn)行了比較研究，但結(jié)果并不一致甚至相互抵觸，這

3、種矛盾影響了研究者對保存方法的選擇。間接地阻礙了糞便DNA技術(shù)的發(fā)展。④未考慮到與DNA提取相關(guān)環(huán)節(jié)對結(jié)果的影響。由于糞便材料的特殊性，它的提取結(jié)果受到多重因素的影響，如樣品的采集、保存等等，忽視其中任何一個環(huán)節(jié)，都會給試驗結(jié)果帶來不利影響甚至導(dǎo)致試驗失敗。 本文以11種哺乳動物糞便為材料，分別構(gòu)建了2種新的提取方法解決了問題①和②；以糞便DNA提取產(chǎn)物的濃度和純度為指標(biāo)，用正交分析對問題③和④進(jìn)行了分析，主要結(jié)果如下：

4、 1、本論文中構(gòu)建的改進(jìn)型CTAB提取方法廣泛適用于各食性哺乳動物糞便DNA提取，成功率高，一般不需重復(fù)提取。我們總計對11種動物糞便進(jìn)行了DNA提取驗證，僅一次提取即得到高質(zhì)量的模板DNA，對PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果也證實了方法的可靠性和通用性。雖然德國QIAGEN公司的糞便DNA提取專用試劑盒QIAampDNAStoolKit也有著較好的通用性，但其昂貴的價格(50元/次)使其在大量分析樣品時受到很大的限制。與之相比，本方法成本低廉

5、，每提取一個樣品的成本低于3元，用實驗室常用試劑即可完成糞便DNA提取，同時產(chǎn)物純度高于專用試劑盒。即擁有超過專業(yè)試劑盒提取效果，又盡可能的降低了實驗成本，真正實現(xiàn)了實驗室通用性，有利于糞便DNA技術(shù)的迅速推廣。 2、在對陳舊糞便DNA提取研究中，通過多管收集—預(yù)處理—有機(jī)溶劑抽提的方法，從無水乙醇常溫保存3～4.5年的陳舊糞便中提取到DNA并成功的進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和測序，實驗效果大大優(yōu)于其他方法。它證明了陳舊糞便DNA提取及

6、應(yīng)用的可行性，解決了因動物的遷出或死亡而無法再獲得這些動物的分子遺傳信息的困難，拓寬了糞便DNA分析技術(shù)的應(yīng)用范圍。 3、通過正交實驗對糞便DNA的純度和濃度分別進(jìn)行分析，得出以下結(jié)論：保存方法、樣品與保存物質(zhì)比例和保存溫度三個因素對糞便DNA提取產(chǎn)物的濃度有顯著影響，但對產(chǎn)物的純度影響不大；保存時間并非影響糞便DNA質(zhì)量的主要因素，因此若保存策略(前三個因素)正確，糞便樣品應(yīng)可以有效保存很長時間。本實驗得出的最佳保存策略為：