DICER在白血病中的功能及GATA-1對其調(diào)控機制的研究.pdf

1、急性白血病是我國常見十大惡性腫瘤之一，它是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，其克隆中的白血病細(xì)胞失去進(jìn)一步分化成熟的能力而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段。在骨髓和其他造血組織中白血病細(xì)胞大量增生積聚并浸潤其他器官和組織，同時使正常造血受抑制，臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染及各器官浸潤癥狀。一般可根據(jù)白血病細(xì)胞系列歸屬分為急性髓系白血病(AML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)兩大類。在成年人中AML是最常見的類型。急性白血病進(jìn)展迅速，如不治療，從起病至死

2、亡的平均時間為2-4個月。一直以來人們不斷探索白血病的發(fā)病機制，從而改善白血病患者的預(yù)后。傳統(tǒng)意義上，白血病是遺傳改變的結(jié)果，包括非隨機的染色體易位改變，如AML的4種最常見易位改變:t(15;17)/PML/RARα融合基因;t(8;21)/AML1-ETO融合基因;Inv(16)/(CBF)b-MYH11融合基因;11q23/MLL融合蛋白。這些細(xì)胞遺傳學(xué)異常改變導(dǎo)致與增生、分化、凋亡相關(guān)的基因不可逆損傷和白血病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄異常。

3、近年來，大量研究表明表觀遺傳改變參與白血病的形成和發(fā)展，其中一些改變可能是早期診斷、預(yù)后評估以及預(yù)測治療效果的標(biāo)志，其中miRNA表達(dá)標(biāo)簽在上述作用中更有價值，可能成為白血病治療的有效靶點。DICER是miRNA形成過程中的關(guān)鍵酶。
　　 DICER是RnaseⅢ（核酸內(nèi)切酶）家族成員，在人類只有DICER1一種，DICER1基因定位于14q32.2，包括28個外顯子，全長52.3kb，在各種組織中廣泛表達(dá)。DICE1能同時將d

4、sRNA和miRNA前體加工成siRNA和成熟miRNA，因此是RNAi機制信號通路中的一種關(guān)鍵酶。已有研究發(fā)現(xiàn)在不同腫瘤中（如在子宮內(nèi)膜腺癌、卵巢癌等癌癥中DICER1表達(dá)水平下調(diào);而在前列腺癌、直腸癌中DICER1表達(dá)水平上調(diào)）及腫瘤的不同發(fā)展階段DICER1的表達(dá)水平不同，且與疾病的預(yù)后相關(guān)，而DICER1與血液系統(tǒng)腫瘤的研究鮮有報道。目前僅有Martin等報道了71例初診AML病人中DICER1高表達(dá)，但未對其功能及調(diào)控機制進(jìn)行

5、研究。因此，本研究檢測AML患者和白血病細(xì)胞系中DICER1表達(dá)水平，并通過RNAi實驗檢測DICER1對白血病細(xì)胞增殖、凋亡的影響。通過對DICER15'旁側(cè)區(qū)1300bp(-1200～+100)的序列進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)在這段序列內(nèi)含有潛在的GATA-1結(jié)合位點，我們推測DICER1在AML中的表達(dá)可能受到轉(zhuǎn)錄因子GATA-1的調(diào)控。GATA-1是造血系統(tǒng)特有的轉(zhuǎn)錄因子，其單獨誘導(dǎo)多能造血干細(xì)胞向紅細(xì)胞系列和巨核細(xì)胞系列分化;研究表明GAT

6、A-1在白血病細(xì)胞系及AML患者中表達(dá)，提示GATA-1可能與AML發(fā)生發(fā)展相關(guān)。通過EMSA、CHIP等實驗鑒定GATA-1是DICER1啟動子區(qū)重要的調(diào)控元件，為揭示DICER1在白血病發(fā)病機制中的作用提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法
　　 一、實驗材料
　　 1、人白血病細(xì)胞系K562，HL-60;人胚腎細(xì)胞系HEK293
　　 2、臨床白血病患者及正常對照者的骨髓標(biāo)本
　　 3、Real-

7、time PCR及Western印跡雜交實驗相關(guān)試劑
　　 4、細(xì)胞增殖、凋亡實驗相關(guān)試劑
　　 5、基因克隆及螢光素酶報告基因檢測相關(guān)試劑
　　 6、電泳泳動遷移實驗及染色質(zhì)免疫沉淀相關(guān)試劑
　　 二、實驗方法
　　 1、Real-time PCR和western-blotting檢測AML患者的骨髓標(biāo)本中DICER1表達(dá)水平。
　　 2、Real-time PCR和Western-bl

8、otting檢測DICER1在白血病細(xì)胞系中的表達(dá)。
　　 3、MTT實驗與細(xì)胞凋亡實驗分別檢測DICER1干擾后對白血病細(xì)胞增殖與凋亡的影響。
　　 4、Real-time PCR方法檢測DICER1干擾后白血病細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達(dá)水平。
　　 5、RT-PCR及Western-blotting檢測AML患者的骨髓標(biāo)本中GATA1的表達(dá)水平。
　　 6、RT-PCR及Wes

9、tern-blotting檢測白血病細(xì)胞系中GATA1的表達(dá)水平。
　　 7、生物信息學(xué)軟件分析DICER1啟動子結(jié)構(gòu)并檢測其活性;
　　 應(yīng)用TRANSFAC-TESS軟件，對DICER1基因5'旁側(cè)序列1300bp(-1200～+100)的序列進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)一個潛在的GATA-1結(jié)合位點(-617～-611)。構(gòu)建系列截短的DICER1啟動子螢光素酶報告基因載體，應(yīng)用螢光素酶檢測系統(tǒng)分析各段啟動子的活性。
　　

10、 8、ChIP實驗驗證在體內(nèi)條件下GATA-1與預(yù)測的DICER1啟動子區(qū)GATA-1反應(yīng)元件結(jié)合。
　　 9、EMSA實驗體外鑒定DICER1啟動子區(qū)GATA-1反應(yīng)元件。
　　 10、Real-time PCR及Western-blotting檢測GATA1干擾后DICER1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　 11、MTT實驗及細(xì)胞凋亡實驗檢測GATA-1干擾后對白血病細(xì)胞功能的影響。
　　 結(jié)果：<

11、br>　　 1、急性髓細(xì)胞白血病患者的骨髓標(biāo)本中DICER1表達(dá)水平顯著高于正常對照組(P＜0.05);
　　 2、白血病細(xì)胞系中DICER1的表達(dá)水平明顯高于HEK293細(xì)胞(P＜0.05);
　　 3、DICER1-shRNA轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞K562、HL-605天后，DICER1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降，干擾效果明顯(P＜0.05);
　　 4、MTT實驗結(jié)果證明:與對照組細(xì)胞相比，DICER1干擾

12、后白血病細(xì)胞增殖力顯著降低(P＜0.05);流式細(xì)胞分析表明:與正常細(xì)胞和對照組細(xì)胞比較，DICER1干擾后白血病細(xì)胞凋亡顯著增加(P＜0.01);
　　 5、Real-time PCR結(jié)果表明DICER1干擾后白血病細(xì)胞K562、HL-60中Caspase-3、Bax表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，Bcl-2表達(dá)顯著下降(P＜0.05)。
　　 6、急性髓細(xì)胞白血病患者的骨髓標(biāo)本中GATA-1表達(dá)水平顯著高于正常對照組(

13、P＜0.05);
　　 7、白血病細(xì)胞系中GATA-1的表達(dá)水平顯著高于HEK293細(xì)胞(P＜0.05);
　　 8、生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測DICER1啟動子區(qū)存在潛在的GATA-1結(jié)合位點(-617～-611);螢光素酶報告基因結(jié)果表明在DICER1上游-652到-489區(qū)間內(nèi)存在正調(diào)控元件;
　　 9、ChIP實驗結(jié)果證明體內(nèi)條件下GATA-1與DICER1啟動子區(qū)的結(jié)合
　　 10、EMSA實驗證明

14、體外條件下GATA-1特異性結(jié)合DICER1啟動子區(qū)GATA-1反應(yīng)元件;
　　 11、RT-PCR及Western-blotting證明GATA-1干擾后DICER1 mRNA和蛋白表達(dá)水平下降;
　　 12、MTT實驗結(jié)果表明GATA-1干擾后白血病細(xì)胞增殖力減弱;
　　 13、流式細(xì)胞分析表明GATA-1干擾后白血病細(xì)胞凋亡增加。
　　 結(jié)論：
　　 1.DICER1在急性髓細(xì)胞白血病中高表