TWIST2在髓系白血病中抑癌基因功能研究.pdf

1、【研究目的】Twist蛋白是一種含有堿性螺旋環(huán)螺旋（bHLH）結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在進(jìn)化過程中高度保守，包括Twist1和Twist2。Twist1與Twist2的結(jié)構(gòu)有66%的相似度，并且在bHLH區(qū)域相似度高達(dá)98%，但其功能并不一致。Twist蛋白在多種實(shí)體瘤中表現(xiàn)為潛在的致癌性，包括調(diào)控 AKT2的表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞上皮至間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)的發(fā)生，在腫瘤細(xì)胞的遷移,侵襲和轉(zhuǎn)移中起作用。Twist在血液系統(tǒng)疾病中的作用與實(shí)體瘤不同，在T

2、wist2-/-小鼠髓系細(xì)胞過度增殖，有骨髓增殖性疾?。∕PD）的表現(xiàn)，說明Twist2對(duì)小鼠骨髓粒系細(xì)胞生長(zhǎng)呈負(fù)調(diào)節(jié)作用，故我們認(rèn)為TWIST2在髓系白血病中可能起到抑癌基因的功能，為進(jìn)一步驗(yàn)證我們的假設(shè)，首次揭示TWIST2在髓系白血病中的作用，我們進(jìn)行了一系列基礎(chǔ)研究，希望能為髓系白血病的治療提供新的思路。
　　【研究方法】收集急性髓系白血病患者骨髓5～10ml，F(xiàn)icoll分離提取單個(gè)核細(xì)胞，同時(shí)收集急性髓系細(xì)胞系（Raj

3、i、Dami、THP-1、SHI-1）細(xì)胞，提取基因組DNA,采用重硫酸鹽限制性內(nèi)切酶法（COBRA）檢測(cè)DNA樣本甲基化程度；直接測(cè)序法檢測(cè)TWIST2基因啟動(dòng)子區(qū)域13個(gè) CpG位點(diǎn)的甲基化；免疫磁珠分選髓系白血病患者CD34+細(xì)胞，包括 AML30例，CML14例，正常對(duì)照6例，相對(duì)實(shí)時(shí)定量 PCR（Q-RT-PCR）檢測(cè)各組TWIST2表達(dá)量；構(gòu)建TWIST2慢病毒載體，磷酸鈣沉淀法制備表達(dá)VENUS對(duì)照及TWIST2基因的慢病

4、毒，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和集落生成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VENUS和TWIST2對(duì)AML細(xì)胞株THP-1和Dami以及CML細(xì)胞株MEG-01和K562中的增殖能力影響；富集AML和CML患者CD34+細(xì)胞，過表達(dá)VENUS和TWIST2，檢測(cè)VENUS和TWIST2對(duì)原代造血干細(xì)胞的影響；在THP-1細(xì)胞中過表達(dá)VENUS和TWIST2，兩組裸鼠皮下注射一定量細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的成瘤能力，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因的功能；為探討TWIST2抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制，F(xiàn)ACS檢

5、測(cè)4個(gè)細(xì)胞系兩組細(xì)胞的周期進(jìn)程，為進(jìn)一步研究TWIST2基因作用的分子機(jī)制，采用點(diǎn)突變及PCR的方法構(gòu)建TWIST2的4種突變體，包括TWIST2蛋白N端缺失（28個(gè)氨基酸）、C端缺失（20個(gè)氨基酸即Twist Box）、basic區(qū)域突變（74、75、76、78位的堿性氨基酸或酸性氨基酸突變?yōu)楸彼幔?、HLH區(qū)域突變（86位苯丙氨酸突變?yōu)楦彼幔?，磷酸鈣沉淀制備含突變體的慢病毒，并Western Blot（WB）檢測(cè)突變體的表達(dá)；K5

6、62細(xì)胞中檢測(cè)TWIST2及其突變體對(duì)細(xì)胞的增殖能力及集落生成能力的影響，F(xiàn)ACS檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)其可能的重要功能結(jié)構(gòu)域；富集4例CML患者CD34+細(xì)胞，在原代造血干細(xì)胞中檢測(cè)VENUS、TWIST2、TWIST2F86P對(duì)細(xì)胞集落生成的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證HLH功能結(jié)構(gòu)域的重要性；為研究TWIST2與伊馬替尼的相互作用，加入不同濃度IM，檢測(cè)K562細(xì)胞的集落生成數(shù)目；為進(jìn)一步探討TWIST2作用的靶基因，首先Microar

7、ray分析比較THP-1/VENUS細(xì)胞和THP-1/TWIST2細(xì)胞的差異表達(dá)基因，進(jìn)一步在K562及CMLCD34+細(xì)胞中用Q-RT-PCR驗(yàn)證與白血病/腫瘤/造血發(fā)生相關(guān)的部分差異表達(dá)基因，CHIP方法檢測(cè)K562細(xì)胞中TWIST2直接作用的靶基因，克隆P21的啟動(dòng)子區(qū)域，luciferase雙報(bào)告基因方法檢測(cè)靶基因P21的轉(zhuǎn)錄活性；
　　【研究結(jié)果】①收集20例急性髓系白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞及4個(gè)細(xì)胞系細(xì)胞， COBRA

8、檢測(cè)TWIST2甲基化程度，其中Raji、Dami、THP-1及部分患者甲基化程度較正常健康志愿者明顯增高，說明TWIST2在急性髓系白血病患者中甲基化程度及比例增高；異常高甲基化導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄沉默，為此我們收集30例AML及14例CML患者CD34+細(xì)胞，Q-RT-PCR檢測(cè)到AML、CML患者TWIST2的表達(dá)與正常對(duì)照組比較降低，兩組分別與正常對(duì)照比較都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；②構(gòu)建過表達(dá)TWIST2的慢病毒載體，比較對(duì)照 V

9、ENUS及 TWIST2對(duì)髓系細(xì)胞（THP-1、Dami、K562、MEG-01）的增殖影響，結(jié)果顯示在4個(gè)細(xì)胞系中TWIST2都能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，兩組比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；對(duì)于單個(gè)細(xì)胞的集落生成實(shí)驗(yàn)中也觀察到同樣的現(xiàn)象，TWIST2對(duì)原代造血干細(xì)胞的集落生成亦存在抑制作用，CML中VENUS組與TWIST2組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；③體外實(shí)驗(yàn)我們已經(jīng)證實(shí) TWIST2對(duì)細(xì)胞的抑制作用，進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明對(duì)照VE

10、NUS組裸鼠成瘤能力明顯高于TWIST2組，兩組（VENUS組與TWIST2組）比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；④體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)均證明TWIST2有抑制作用，進(jìn)一步FACS檢測(cè)TWIST2對(duì)細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示在4個(gè)細(xì)胞系中，TWIST2都能抑制細(xì)胞G1-S期轉(zhuǎn)換，在TWIST2組細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，細(xì)胞分裂受阻，3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)兩組（VENUS組與TWIST2組）比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；⑤為進(jìn)一步探討TWIS

11、T2作用的分子機(jī)制，構(gòu)建TWIST2突變體，細(xì)胞增殖及集落生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示 TWIST2抑制 K562細(xì)胞生長(zhǎng)依賴bHLH區(qū)域，N-和C-并不是必需的區(qū)域；富集CMLCD34+細(xì)胞，VENUS、TWIST2、TWIST2F86P慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，接種 CD34+細(xì)胞到含細(xì)胞因子的半固體甲基纖維素培養(yǎng)基，集落生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TWIST2可以抑制CMLCD34+細(xì)胞的各種集落生成，而TWIST2F86P組集落數(shù)目明顯增多，VENUS組及TW

12、IST2F86P組分別與TWIST2組比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），進(jìn)一步說明HLH區(qū)域是TWIST2抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的重要功能結(jié)構(gòu)域；⑥FACS檢測(cè)TWIST2及其突變體對(duì)K562細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明TWIST2F86P及VENUS與TWIST2比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），G0/G1期細(xì)胞阻滯消失；⑦IM處理轉(zhuǎn)染TWIST2及其突變體的K562細(xì)胞，結(jié)果顯示過表達(dá)TWIST2可以增強(qiáng)K562細(xì)胞對(duì)IM的敏感性；⑧為進(jìn)一步

13、探討TWIST2的作用機(jī)制，Microarray分析到THP-1/VENUS和THP-1/TWIST2之間的差異表達(dá)基因共662個(gè)，Q-RT-PCR驗(yàn)證與造血及腫瘤相關(guān)的基因15個(gè)，K562細(xì)胞和CMLCD34+細(xì)胞過表達(dá)TWIST2后Q-RT-PCR檢測(cè)相關(guān)差異表達(dá)的基因，P21及ID2的表達(dá)增高，TERT及CCND1的表達(dá)降低；CHIP檢測(cè)TWIST2的靶基因，結(jié)果顯示TWIST2組ID2、P21、CCND1基因的富集，是TWIST

14、2的靶基因；克隆細(xì)胞周期相關(guān)基因P21的啟動(dòng)子，luciferase檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TWIST2組P21的轉(zhuǎn)錄活性明顯比VENUS組和TWIST2F86P組高，P21是TWIST2的直接作用靶基因，TWIST2調(diào)控P21的轉(zhuǎn)錄活性。
　　【結(jié)論】
　　綜上所述，急性髓系白血病患者中TWIST2啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度增高，而正常對(duì)照無甲基化。因?yàn)?TWIST2啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化導(dǎo)致基因的表達(dá)沉默，故AML及 CML CD34+細(xì)胞中