AF1q、CD44和circRNA在白血病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 AF1q調(diào)控CD44在慢性髓性白血病細(xì)胞增殖及耐藥中的作用及機(jī)制研究
　　研究背景:
　　慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，Ph染色體和BCR/ABL融合基因是CML的標(biāo)記性改變。BCR/ABL蛋白具有活躍的酪氨酸激酶活性，可促使造血干細(xì)胞向髓系祖細(xì)胞分化，引發(fā)髓系細(xì)胞擴(kuò)增并抑制其凋亡，最終導(dǎo)致CML的發(fā)生。酪氨酸激酶抑制劑(t

2、yrosine kinase inhibitor，TKI)能選擇性抑制BCR/ABL蛋白的酪氨酸激酶活性，可顯著改善CML患者的預(yù)后，開創(chuàng)了靶向治療的新時代。然而，隨著臨床上的廣泛應(yīng)用和時間的推移，TKI的耐藥現(xiàn)象日益明顯，復(fù)發(fā)率逐漸升高，嚴(yán)重影響了CML的治療效果。因此，探索TKI的耐藥機(jī)制，尋找新的治療靶點，成為目前CML研究的熱點之一。
　　AF1q基因（又名MLLT11）定位于人類染色體1q21，是混合譜系白血病基因(mi

3、xed-lineage leukemia，MLL)的伙伴基因。研究顯示其表達(dá)水平在急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(acutelymphoblastic leukemia， ALL)患者中普遍升高，且AF1q高表達(dá)在AML及骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)中是一個獨立的預(yù)后不良因素。以上結(jié)果提示，AF1q可能在白血病中發(fā)揮著重要的作用

4、。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，AF1q在CML患者中表達(dá)升高，而且在CML CD34+白血病干/祖細(xì)胞中的升高水平尤為明顯。然而，目前有關(guān)AF1q基因功能的報道極少，其在白血病中發(fā)揮作用的途徑及機(jī)制尚不清楚。
　　研究目的:
　　研究AF1q在CML不同分期患者體內(nèi)的表達(dá)水平;明確AF1q表達(dá)異常對CML細(xì)胞增殖及藥物敏感性的影響;探討AF1q在CML中發(fā)揮作用的機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)伊馬替尼(Imatinib，IM)耐藥、預(yù)防CML復(fù)發(fā)提供新

5、的治療靶點。
　　研究方法:
　　1.標(biāo)本采集及細(xì)胞分選:收集149例CML患者和15例健康對照者的骨髓標(biāo)本，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液提取骨髓中的單個核細(xì)胞。磁珠法分選13例CML初診慢性期患者和7例健康對照者骨髓標(biāo)本中的CD34+細(xì)胞。
　　2.AF1q表達(dá)水平檢測:Real-Time RT-PCR檢測CML各期患者和健康對照者骨髓原代細(xì)胞及CD34+細(xì)胞中AF1q的mRNA表達(dá)水平。
　　3.構(gòu)建AF1q表達(dá)載體及

6、合成小干擾片段:在293T細(xì)胞中包裝攜帶有AF1q表達(dá)載體(pLOC-AF1q)和陰性對照質(zhì)粒(pLOC-NC)的慢病毒;合成針對AF1q基因的siRNA和陰性對照片段NC siRNA。
　　4.轉(zhuǎn)染CML細(xì)胞系、原代細(xì)胞及CD34+細(xì)胞:應(yīng)用pLOC-AF1q及pLOC-NC病毒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞系（AF1q上調(diào)組與對照組），blasticidin篩選至少2周后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞;應(yīng)用Lipofectamine2000將AF1q

7、siRNA和NCsiRNA轉(zhuǎn)染K562/G01細(xì)胞系、CML初診原代細(xì)胞及CD34+細(xì)胞（AF1q下調(diào)組與對照組）。Real-Time RT-PCR和Western blot分別驗證AF1q的上、下調(diào)效率。
　　5.細(xì)胞增殖、凋亡及藥物敏感性檢測:將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，CCK8法檢測細(xì)胞增殖速度;加入IM孵育48小時，CCK8法檢測藥物敏感性、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率變化。
　　6.動物實驗:NOD/SCID免疫缺

8、陷小鼠經(jīng)1.5Gy射線照射后，尾靜脈注射AF1q上調(diào)組及對照組K562細(xì)胞，4周及8周后分別應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓及脾臟中人源性CD33分子（K562細(xì)胞標(biāo)志性表面分子）含量。
　　7.芯片檢測:應(yīng)用全基因組芯片技術(shù)篩選AF1q上調(diào)組及對照組K562細(xì)胞之間差異表達(dá)的mRNA，針對芯片結(jié)果行GO及pathway分析。
　　8.CD44表達(dá)水平檢測:選取芯片結(jié)果中具有差異性表達(dá)的CD44作為AF1q下游候選分子。Real-Ti

9、me RT-PCR檢測CML初診慢性期患者骨髓原代細(xì)胞及CD34+細(xì)胞中CD44的mRNA表達(dá)水平，并分析其與AF1q的相關(guān)關(guān)系。
　　9.封閉CD44分子:在AF1q上調(diào)組K562細(xì)胞中，應(yīng)用中和抗體阻斷CD44的生物學(xué)作用，觀察其對細(xì)胞增殖、凋亡和藥物敏感性方面的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.CML患者AF1q的表達(dá)情況:與健康對照者相比，AF1q在CML各期患者中表達(dá)水平均明顯增高，且慢性期(Chronic p

10、hase，CP)、加速期(acceleratephase，AP)或急變期(blast phase，BP)患者的表達(dá)水平明顯高于CR患者;CR患者的表達(dá)水平則顯著高于健康對照者。進(jìn)一步結(jié)果顯示，CML初診患者CD34+細(xì)胞中AF1q的表達(dá)水平明顯高于同源CD34-細(xì)胞，同時高于健康對照者的CD34+細(xì)胞，提示AF1q可能在CML白血病干細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。
　　2.AF1q表達(dá)下調(diào)對細(xì)胞凋亡及藥物敏感性的影響:在CML原代細(xì)胞及CD

11、34+細(xì)胞中下調(diào)AF1q表達(dá)后，CCK8結(jié)果顯示細(xì)胞對IM誘導(dǎo)的藥物敏感性增強(qiáng)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明細(xì)胞凋亡率增加。
　　3.AF1q表達(dá)上調(diào)對細(xì)胞增殖、凋亡及藥物敏感性的影響:在IM敏感細(xì)胞株K562中上調(diào)AF1q表達(dá)后，CCK8結(jié)果顯示細(xì)胞增殖速度加快、對IM誘導(dǎo)的藥物敏感性降低，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明細(xì)胞凋亡率減少。同時，在IM耐藥細(xì)胞株K562/G01中下調(diào)AF1q表達(dá)后，CCK8結(jié)果顯示細(xì)胞增殖速度減慢、對IM誘導(dǎo)的藥物敏感性

12、增強(qiáng)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明細(xì)胞凋亡率增加。以上結(jié)果表明，AF1q可參與調(diào)控CML細(xì)胞的增殖、藥敏與凋亡。
　　4.AF1q表達(dá)上調(diào)對CML細(xì)胞體內(nèi)定植能力的影響:尾靜脈注射細(xì)胞4周及8周后，AF1q上調(diào)組小鼠脾內(nèi)K562細(xì)胞含量均高于對照組小鼠;骨髓中K562細(xì)胞定植較少，4周后兩組小鼠骨髓中K562細(xì)胞含量無明顯差異，8周后AF1q上調(diào)組小鼠骨髓中K562細(xì)胞含量高于對照組。
　　5.芯片結(jié)果:應(yīng)用全基因組芯片技術(shù)在AF1q

13、上調(diào)組及對照組K562細(xì)胞之間篩選出582個差異性表達(dá)基因，其中上調(diào)基因465個，下調(diào)基因117個。GO及pathway分析發(fā)現(xiàn)，K562過表達(dá)AF1q后生物學(xué)行為改變涉及細(xì)胞生長、機(jī)體發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及刺激應(yīng)答等方面，主要涉及凋亡相關(guān)通路、腫瘤轉(zhuǎn)錄異常調(diào)節(jié)、Ras、PI3K-AKT、mTOR等信號通路。在結(jié)果中選擇表達(dá)差異明顯、與白血病發(fā)病與耐藥有密切關(guān)系的CD44作為AF1q下游候選分子。
　　6.CML患者CD44的表達(dá)情況以

14、及與AF1q的相關(guān)關(guān)系:在CML初診CP期患者骨髓原代細(xì)胞及CD34+細(xì)胞中，CD44表達(dá)水平與AF1q表達(dá)均呈顯著正相關(guān);在CML細(xì)胞中上、下調(diào)AF1q表達(dá)后，CD44分子表達(dá)亦隨之上、下調(diào)。此外，在CD34+細(xì)胞中，CD44的表達(dá)水平明顯高于同源CD34-細(xì)胞。以上結(jié)果提示，在CML中AF1q能正向調(diào)控CD44的表達(dá)。
　　7.AF1q通過調(diào)控CD44發(fā)揮生物學(xué)功能:在AF1q上調(diào)組K562細(xì)胞中阻斷CD44分子后，CCK8結(jié)

15、果顯示細(xì)胞增殖速度減慢、對IM誘導(dǎo)的藥物敏感性增強(qiáng)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明細(xì)胞凋亡率增加。由此可見，在CML中AF1q可通過調(diào)控CD44發(fā)揮其生物學(xué)功能。
　　結(jié)論:
　　1.AF1q在CML各期患者中的表達(dá)水平均高于健康對照者，提示AF1q在CML的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。
　　2.通過調(diào)控AF1q表達(dá)水平，可改變CML細(xì)胞的增殖速度、藥物敏感性及藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率，證實AF1q在CML中具有促進(jìn)增殖、降低藥物敏感性以及

16、抵抗凋亡的作用。
　　3.AF1q在CML中具體作用機(jī)制之一是通過調(diào)控CD44的表達(dá)介導(dǎo)，這兩種分子可能為CML的治療提供新靶點。
　　關(guān)鍵詞:AF1q/MLLT11;慢性髓性白血病;藥物敏感性;CD44
　　第二部分 circRNA在急性髓性白血病中的表達(dá)譜及生物信息學(xué)分析
　　研究背景:
　　急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一類異質(zhì)性很強(qiáng)的造血系統(tǒng)惡性疾患，常常伴

17、隨多種遺傳學(xué)及基因?qū)W異常。AML的治療主要以化療為主，但治療過程中出現(xiàn)的耐藥、復(fù)發(fā)以及毒副作用，使病死率一直維持在較高的水平。隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，AML的各類生物學(xué)指標(biāo)逐漸被熟知，其中細(xì)胞遺傳學(xué)及分子學(xué)指標(biāo)尤為突出，成為輔助診斷、指導(dǎo)治療及預(yù)后分層的有力工具。近年來，圍繞DNA突變、microRNA及l(fā)ncRNA等方向的大量研究正廣泛開展，致力于發(fā)現(xiàn)更多的AML生物學(xué)指標(biāo)，提高對白血病特點的認(rèn)識，以助于監(jiān)測微小殘留病變、提高預(yù)警能

18、力和開發(fā)新型靶向治療藥物。
　　環(huán)狀RNA(Circular RNAs，circRNAs)是一類廣泛存在的非編碼RNA，以往的相關(guān)報道較為少見。circRNA具有閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被降解，因而比同源線性RNA更為穩(wěn)定。在早期的研究中，circRNA被認(rèn)為形成于外顯子轉(zhuǎn)錄本的錯誤剪接，作為隨機(jī)產(chǎn)物并不具備生物學(xué)功能，然而隨著生物信息學(xué)及高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展，大量circRNA被發(fā)現(xiàn)并引起關(guān)注。越來越多的證據(jù)表明，circRNA

19、并非偶然產(chǎn)生，其豐度高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并存在時空表達(dá)特異性，很可能在調(diào)控生物體基因表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用。另有少量研究報道，circRNA可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著某種作用，然而其在AML疾病進(jìn)程中的表達(dá)及功能尚不清楚。
　　研究目的:
　　研究AML中circRNA的表達(dá)譜，篩選出與AML危險度分層相關(guān)的特異性circRNA;尋找circRNA表達(dá)譜中潛在的AML診斷指標(biāo)和治療靶點，并對其進(jìn)行特征鑒定和功能分析。
　

20、　研究方法:
　　1.標(biāo)本采集:收集113例AML患者和12例健康對照者的骨髓標(biāo)本，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液提取標(biāo)本中的單個核細(xì)胞。10例標(biāo)本用于circRNA芯片檢測，115例標(biāo)本用于后續(xù)研究。
　　2.芯片檢測:提取10例標(biāo)本（6例AML，4例健康對照）的總RNA并用RNA酶處理，除去線性RNA后轉(zhuǎn)錄為熒光素標(biāo)記的互補(bǔ)RNA，繼而用于芯片雜交。掃描并分析孵育后的雜交芯片，獲得標(biāo)準(zhǔn)化的circRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。
　　3.Re

21、al-Time RT-PCR驗證表達(dá)水平:提取115例標(biāo)本的總RNA并轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用Real-Time RT-PCR檢測并獲取相關(guān)基因的Ct值，GAPDH作為內(nèi)參用于數(shù)據(jù)分析。
　　4.miRNA預(yù)測及功能分析:應(yīng)用Arraystar軟件預(yù)測circRNA-miRNA的相互作用;應(yīng)用Cytoscape描繪circRNA-miRNA-mRNA/gene interaction網(wǎng)絡(luò)圖;應(yīng)用GO及KEGG分析預(yù)測靶基因的相關(guān)功能及

22、通路。
　　研究結(jié)果:
　　1.AML患者中的circRNA表達(dá)譜:在芯片13617個circRNA的檢測范圍內(nèi)，4573個circRNA可被檢測到信號，其中464個circRNA在AML中差異性表達(dá)，上調(diào)147個，下調(diào)317個。與健康對照者相比，AML患者中12個circRNA的差異表達(dá)倍數(shù)高達(dá)10倍以上。
　　2.AML危險度分層相關(guān)的特異性circRNA:
　　2.1進(jìn)一步研究低危及高危組AML患者結(jié)果發(fā)現(xiàn)

23、，2個上調(diào)circRNA(hsa_circ_0035381，hsa_circ_0049657)和3個下調(diào)circRNA(hsa_circ_0001187，hsa_circ_0008078，hsa_circ_0001947)的表達(dá)與AML危險度分層相關(guān)。
　　2.2 circRNA可作為miRNA海綿競爭性調(diào)控miRNA的生物活性。GO及KEGG分析以上5個circRNA相關(guān)的miRNA及其靶基因，結(jié)果顯示此類AML危險度分層特異性

24、circRNA可參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程及信號通路。
　　3.hsa_circ_0004277在AML中的表達(dá)情況:
　　3.1在AML特異性circRNA表達(dá)譜中，選取表達(dá)水平較高、下調(diào)倍數(shù)明顯的hsa_ circ_0004277作為研究對象，探索其在AML中的表達(dá)情況。與健康對照者相比，hsa_ circ_0004277在初診未治AML患者中表達(dá)水平明顯降低;患者經(jīng)治療達(dá)到CR后，hsa_circ_0004277表達(dá)得以恢

25、復(fù)，與健康對照者無差異;當(dāng)CR患者病情復(fù)發(fā),hsa_ circ_0004277表達(dá)水平再次降低，與初診未治階段相似。
　　3.2 ROC曲線分析結(jié)果顯示，hsa_circ_0004277的曲線下面積為0.957，作為AML預(yù)后指標(biāo)具有較高潛力。
　　3.3 hsa circ0004277同源線性RNA WDR37在初診未治AML患者中表達(dá)水平較健康對照組明顯降低，在CR組患者中表達(dá)得以恢復(fù)，與hsa_circ_0004277

26、情況類似。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，AML患者中hsa_ circ_0004277和WDR37的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)。
　　4.化療對AML患者h(yuǎn)sa circ_0004277表達(dá)水平的影響:在AML患者初診未治階段及CR階段監(jiān)測hsa_circ_0004277的表達(dá)變化，針對每一患者兩階段結(jié)果配對分析發(fā)現(xiàn)，化療成功后，hsa_ circ_0004277表達(dá)水平得以顯著提升。
　　5.hsa_ circ_0004277的靶向miR

27、NA預(yù)測及生物信息學(xué)分析:circRNA_miRNA-mRNA/gene interaction網(wǎng)絡(luò)圖顯示，預(yù)測結(jié)果中hsa-miR-138-5p及hsa-miR-30c-1-3p具有較為復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，hsa-miR-892b, hsa-miR-571，and hsa-miR-328-3p靶基因則相對較少。其中，SH3GL2, PPARGC1A，PIP4K2C，SH2B3，ZNF275及ATP1B4六個靶基因受到2個miRNA調(diào)控