黃花梨及其綠皮芽變果皮發(fā)育特性和差異表達基因的克隆與功能分析.pdf

1、果皮色澤是梨果重要的農(nóng)藝性狀和商品外觀品質(zhì)之一，也是消費者在購買前先得到的感官感受之一。培育不同果皮色澤的梨果以滿足消費者多元化的需求是梨育種的一個長期目標，梨的果皮色澤研究正逐漸成為梨研究的熱點。研究褐皮和綠皮梨果皮發(fā)育和果皮色澤形成期間的差異表達基因，可以深入理解梨褐皮和綠皮果實的形成機制，推進褐皮和綠皮梨分子育種理論形成和育種工作開展。褐皮梨及其綠皮芽變?yōu)槔娴墓ど珴裳芯刻峁┝死硐氲难芯坎牧稀?br>　　 本文首先對黃花梨（果皮

2、為褐色）的綠皮芽變——綠皮黃花進行了生物學特性的研究，其次對比研究了黃花梨和綠皮黃花梨成熟果實果皮結(jié)構(gòu)、表皮膜結(jié)構(gòu)，不同發(fā)育時期果點的發(fā)育、果皮發(fā)育和表皮膜發(fā)育，綠皮黃花梨成熟果實不同顏色果銹果皮與黃花梨褐色果皮的特性，然后以確定的黃花梨果皮色澤關鍵發(fā)育期時的兩種梨果皮為材料，提取了高分子量RNA，用差異顯示PCR(DDRT-PCR)和5'RACE等技術克隆了在黃花梨和綠皮黃花梨果皮中差異表達的梨防御素基因PpyDFN1全長和苯丙氨酸解

3、氨酶基因片段，并對PpyDFN1進行了序列分析和亞細胞定位研究;接著對黃花梨和綠皮黃花梨不同發(fā)育時期果皮中參與苯丙烷次生代謝的苯丙氨酸解氨酶基因PpyPAL1、肉桂酸-4-羥化酶基因PpyC4H和肉桂酰CoA氧化還原酶基因PpyCCR表達水平進行了分析，以評估果皮發(fā)育期間兩種梨果皮中的次生代謝水平差異。最后對PpyDFN1在黃花梨和綠皮黃花梨中的表達特點、轉(zhuǎn)基因煙草中的功能和體外抑菌功能進行了研究。主要研究結(jié)果如下。
　　 1.

4、綠皮黃花為黃花梨穩(wěn)定的綠皮芽變，其果皮為綠色，成熟期較黃花梨提前7～10天，果實可溶性總糖、總可溶性固形物和可滴定酸高于黃花梨，果實硬度低于黃花梨，其它植物學特性和結(jié)果習性都與黃花梨接近。
　　 2.黃花梨與綠皮黃花梨的果點發(fā)育明顯不同，黃花梨果點形成早而集中，果點發(fā)育快，果點大小較同期綠皮黃花梨果點大，而綠皮黃花梨果點形成晚，果點發(fā)育慢;黃花梨果面蠟質(zhì)在花后10周以前較多，花后10周以后果面蠟質(zhì)不斷減少，而綠皮黃花梨果面蠟質(zhì)從

5、觀察開始的花后4周到果實成熟一直存在;黃花梨角質(zhì)膜花后10周前基本完整，從10周時從果點周圍出現(xiàn)裂口到果實成熟時完全龜裂，而綠皮黃花梨果皮角質(zhì)膜從幼果到果實成熟都保持完整，很少破裂;開花后10周以前，黃花梨與綠皮黃花梨表皮膜都是完整和無色透明的，開花后10周以后，黃花梨角質(zhì)膜逐漸破裂，直至完全龜裂，裸露的表皮細胞木栓化，表皮膜呈現(xiàn)黃褐色，而綠皮黃花梨表皮膜從幼果到成熟都相對完整，無色透明，其表皮細胞很少木栓化;黃花和綠皮黃花梨果皮結(jié)構(gòu)從

6、外到內(nèi)依次為角質(zhì)膜、表皮細胞層和亞表皮細胞層，成熟黃花梨果皮表面粗糙，角質(zhì)膜不完整，其下或裸露的表皮細胞木栓化，不能被間苯三酚染色，顏色為黃褐色，而成熟綠皮黃花梨果皮表面光滑，角質(zhì)膜完整，其下表皮細胞為綠色或無色，沒有木栓化。成熟黃花梨果實的表皮膜為黃褐色，是果皮顏色的決定者，而綠皮黃花梨果實表皮膜無色透明，不決定果皮色澤。
　　 3.綠皮黃花梨的深銹果皮與黃花梨的黃褐色果皮本質(zhì)上是一樣的，而淺銹果皮和深銹果皮的區(qū)別主要在于角質(zhì)

7、膜的受損程度、表皮細胞的木栓化程度和木栓化表皮細胞層的完整性。
　　 4.用黃花梨和綠皮黃花梨果皮為材料，建立了一種從果皮中分離高分子量RNA(HMW RNA)和低分子量RNA(LMW RNA)方法。用果皮中所提取的高分子量RNA合成的cDNA作為DDRT-PCR模板，克隆差異片段，結(jié)合5'RACE及5'同源簡并引物擴增，克隆了黃花梨和綠皮黃花梨果皮中差異表達基因——梨防御素基因PpyDFN1（GenBank登錄號為HM0448

8、53）和苯丙氨酸解氨酶基因PpyPAL1。實時熒光定量PCR進一步確定了兩個基因在8周的黃花梨和綠皮黃花梨果皮中表達量存在差異，其中PpyDFN1在黃花梨果皮中的表達量為綠皮黃花梨果皮中表達量的6.7倍，苯丙氨酸解氨酶基因PpyPAL1在黃花梨果皮中的表達量為綠皮黃花梨果皮中的2.2倍。
　　 黃花梨防御素基因PpyDFN1的全長cDNA序列為567bp，包括72bp的5'非翻譯區(qū)，258bp的3'非翻譯區(qū)和237bp的編碼區(qū)。

9、在5'非翻譯區(qū)含有一個(TC)7簡單重復序列。編碼區(qū)編碼一條長度為78個氨基酸殘基組成的多肽鏈，該多肽鏈的分子量為8.65 KDa，等電點為9.36。BLASTP序列分析表明，該多肽鏈為防御素的前體序列。信號肽預測分析表明，多肽鏈的前31個氨基酸序列為防御素的信號肽，余下47個氨基酸殘基組成的序列為成熟的防御素。梨防御素三維結(jié)構(gòu)的同源比對建模表明，防御素PpyDFN1呈現(xiàn)出典型的由一個α-螺旋，三個反向平行的β-折疊組成的βαββ防御素

10、結(jié)構(gòu)?；蚪M序列克隆和分析表明，PpyDFN1的基因組序列在黃花和綠皮黃花中沒有差異，都含有一個內(nèi)含子和2個外顯子。構(gòu)建的亞細胞定位載體用于轟擊洋蔥表皮細胞結(jié)果表明，PpyDFN1定位在細胞壁上。
　　 5.黃花梨和綠皮黃花梨花后6周到10周的果皮中PpyPAL1、PpyC4H和PpyCCR表達量較高，其中在黃花梨果皮中PpyPAL1和PpyCCR表達量顯著高于綠皮黃花梨果皮中的表達量。上述基因高表達量發(fā)生時期與果點形成和擴大期

11、吻合，一定程度上反映了此時期果皮中旺盛的次生代謝活動。而黃花梨果皮中PpyPAL1和PpyCCR較高的表達量，反映了黃花梨果皮較綠皮黃花梨果皮中有著更為旺盛的苯丙烷類物資代謝活動。
　　 6.梨防御素PpyDFN1在根、葉片、花梗、萼片、花瓣、雌蕊和柱頭、雄蕊、種子、果肉和果皮中基礎性表達。PpyDFN1基因的表達表現(xiàn)出果點發(fā)育時期依賴性，在果點形成和擴大期表達量較高，在果點形成后期表達量較低;PpyDFN1在黃花梨果皮中的表達

12、量總體上較綠皮黃花梨高。機械損傷、乙烯、水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和H2O2都能促進PpyDFN1的表達，而ABA不能。
　　 7.表達PpyDFN1的煙草葉片提高了對灰霉菌的抗性;轉(zhuǎn)PpyDFN1基因植株節(jié)間縮短，高度降低，開花延遲，花器官較短，花梗較短，花梗較粗，花筒較粗等;表達PpyDFN1基因的T1代轉(zhuǎn)基因幼苗的根系明顯短于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡Ｓ面囯x子樹脂從轉(zhuǎn)基因植株中純化了PpyDFN1，純化的蛋白洗脫液可以抑制