TNF-α基因shRNA影響脊柱結(jié)核破骨細(xì)胞形成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建靶向TNF-α基因的shRNA載體，觀察其對脊柱結(jié)核破骨細(xì)胞形成的影響，為后續(xù)脊柱結(jié)核骨質(zhì)破壞的干預(yù)性研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　結(jié)核菌素純蛋白衍生物（PPD）誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞，采用細(xì)胞增殖與毒性（CCK）試驗(yàn)檢測PPD對細(xì)胞增殖的影響，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色觀察破骨細(xì)胞的形成，比較不同劑量（0、2、20、50、100μL）及誘導(dǎo)時間（1、4、7天）條件下，破骨細(xì)胞形成的差異

2、。通過qPCR和Western Blotting檢測PPD誘導(dǎo)1、4、7天TNF-α的表達(dá)。雙酶切法構(gòu)建靶向TNF-α基因的shRNA，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR觀察轉(zhuǎn)染后1、3、5、7天TNF-α基因的表達(dá)，收集轉(zhuǎn)染后第三天的細(xì)胞，qPCR檢測轉(zhuǎn)染后TNF-α和RANK基因的表達(dá)，Western Blotting檢測TNF-α蛋白的表達(dá)，TRAP染色計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染后第7天破骨細(xì)胞形成的數(shù)量。

3、r>　　結(jié)果：
　　PPD抑制RAW264.7細(xì)胞的增殖；TRAP染色可見破骨細(xì)胞形成；不同劑量PPD誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的數(shù)量：PPD0μL組為（1.67±0.58）個、2μL組（4.67±0.58）個、20μL組（16.67±0.52）個、50μL組（10.67±2.89）個、100μL組（1.33±0.58）個；20μL PPD誘導(dǎo)1、4、7天破骨細(xì)胞形成的數(shù)量：1天組為（1.50±0.55）個、4天組為（7.50±1.87）個

4、、7天組為（17.33±2.07）個；PPD誘導(dǎo)1、4、7天TNF-α基因的表達(dá)量為：對照組：（1±0），1天組：（4.267±0.737），4天組：（13.60±0.648），7天組：（14.07±1.013），TNF-α蛋白的表達(dá)量，對照組為：（0.066±0.004）,1天組：（0.081±0.005）,4天組：（0.162±0.003）,7天組：（0.179±0.005）；轉(zhuǎn)染前后TNF-α基因的表達(dá)量：轉(zhuǎn)染前為（1.426±0

5、.086），轉(zhuǎn)染后為（0.464±0.029）；轉(zhuǎn)染前后RANK基因的表達(dá)量：轉(zhuǎn)染前為（1.393±0.007），轉(zhuǎn)染后為（1.154±0.006）；轉(zhuǎn)染前后TNF-α蛋白的表達(dá)量：轉(zhuǎn)染前為（82.72±1.843），轉(zhuǎn)染后為（55.34±0.824）；轉(zhuǎn)染前后破骨細(xì)胞形成的數(shù)量：轉(zhuǎn)染前為（56.67±3.786）個，轉(zhuǎn)染后為（19.33±1.528）個。
　　結(jié)論：
　　PPD可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成，且破骨細(xì)胞形成與PPD之