紫杉醇對破骨細(xì)胞形成、分化及凋亡的影響.pdf

1、目的:利用RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞株（破骨前驅(qū)細(xì)胞株）培養(yǎng)系，研究紫杉醇對體外培養(yǎng)的破骨前驅(qū)細(xì)胞形成及分化的影響，并通過流式細(xì)胞技術(shù)，觀察紫杉醇是否通過調(diào)亡途徑抑制破骨前驅(qū)細(xì)胞的形成及分化。
　　 方法:選用RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞株（破骨前驅(qū)細(xì)胞株），進(jìn)行破骨細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察紫杉醇對破骨細(xì)胞形成及分化的影響，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析紫杉醇是否對破骨細(xì)胞凋亡途徑有影響。
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)及藥物添加:

2、　　 1.1、細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng):從-70℃液氮罐中取凍存RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞株2管，迅速放入37℃恒溫水浴箱中快速復(fù)蘇（復(fù)蘇時(shí)間小于1分鐘），然后放至盛有10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液的離心管中離心5分鐘(1000轉(zhuǎn)/分)，棄去上清液，再加入含10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液10ml，吹打混勻后使形成單細(xì)胞懸液，然后移至培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育48-72小時(shí)，待培養(yǎng)瓶底細(xì)胞密度達(dá)到90％以上時(shí)，用1％胰酶

3、+EDTA將細(xì)胞重懸收集細(xì)胞于離心管內(nèi)離心5分鐘（1000轉(zhuǎn)/分），離心后棄去上清液，再加入含10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液5ml，充分吹打混勻后使細(xì)胞重懸成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板算出此時(shí)的細(xì)胞濃度，然后配制成4.5×104cells/ml目的濃度的細(xì)胞懸液，加入破骨細(xì)胞分化因子sRANKL50ng/ml、青霉素100單位/ml和鏈霉素100ug/ml。將細(xì)胞播種于96孔培養(yǎng)板（4行6列）中，每孔加入濃度為4.5×104cells/

4、ml的細(xì)胞懸液150ul。將培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)5天。
　　 1.2、藥物的添加:將配好濃度的細(xì)胞播種在經(jīng)滅菌處理的96孔培養(yǎng)板中（共4行6列），將第一列作為本次實(shí)驗(yàn)的對照組，不添加藥物。第二至五列依次加入紫杉醇，其濃度分別為10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L。每個(gè)濃度每列添加4孔。
　　 2、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色:細(xì)胞培養(yǎng)至第5天后行TRAP染色（按試劑盒

5、說明操作），然后在倒置光鏡下觀察，計(jì)算TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)。觀察紫杉醇對破骨前驅(qū)細(xì)胞的抑制作用。
　　 3、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:
　　 3.1、細(xì)胞培養(yǎng):將復(fù)蘇后擬用于流式細(xì)胞檢測的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，待培養(yǎng)瓶底的細(xì)胞密度達(dá)到90％以上時(shí)，從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，用1％胰酶+EDTA消化細(xì)胞，然后加入含10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液8ml吹打混勻使細(xì)胞重懸，收集細(xì)胞至15ml離心管內(nèi)離心5分鐘（1000轉(zhuǎn)/分），然后棄去上清液

6、，再次加入含10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液5ml，吹打混勻后形成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板算出此時(shí)細(xì)胞原液濃度，然后再根據(jù)公式配制成目的濃度為4.5×104cells/ml的細(xì)胞懸液，并向配置好的細(xì)胞懸液中加入sRANKL50ng/ml、青霉素100單位/ml和鏈霉素100ug/ml。將加好細(xì)胞因子及雙抗的細(xì)胞懸液播種于24孔板的兩孔中，每孔加入500μl濃度為4.5×104cells/ml的細(xì)胞懸液。
　　 3.2、藥物的添加

7、:在24孔培養(yǎng)板第一孔為對照組，不添加任何藥物。第二孔選取行TRAP染色后對破骨前驅(qū)細(xì)胞形成抑制最明顯的紫杉醇濃度為添加藥物組（本實(shí)驗(yàn)選用10-5mol/L）。
　　 3.3、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:細(xì)胞培養(yǎng)至第5天，用1％胰酶+EDTA消化細(xì)胞并將細(xì)胞重懸，然后分別收集到兩個(gè)離心管中，其中一管為對照組另一管為加藥組，放入離心機(jī)內(nèi)離心5分鐘（1000轉(zhuǎn)/分），棄上清液。然后添加4℃保存的PBS緩沖液8ml，吹打混勻使細(xì)胞成單細(xì)胞

8、懸液，再次離心5分鐘（1000轉(zhuǎn)/分），棄上清液。以300μl1x緩沖液將細(xì)胞重懸，每管加入Annexin(Ⅴ)5μl、Pi10μl，靜置30分鐘，再加入200μl1x緩沖液，立刻將細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀依次檢測添加藥物后培養(yǎng)至第5天的細(xì)胞凋亡情況。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)處理采用非參數(shù)檢驗(yàn)的方差分析和S-N-K檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果:
　　 1、破骨前驅(qū)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征:細(xì)胞

9、培養(yǎng)第一天各組未見破骨細(xì)胞形成;第二、三天可見有少量破骨細(xì)胞形成;第五天時(shí)各組均可見到破骨前驅(qū)細(xì)胞。行TRAP染色后鏡下可見到大量染色陽性細(xì)胞，其形態(tài)學(xué)特征為:細(xì)胞體積較小，形態(tài)不規(guī)則，呈橢圓形、梭形、條索狀或不規(guī)則形:胞漿豐富，呈紫紅色，細(xì)胞核較小，數(shù)目多為1-2個(gè)，偶可見到3核者。
　　 2、紫杉醇對破骨細(xì)胞的形成和分化具有抑制作用。在同等條件下，藥物濃度越低則形成的破骨細(xì)胞數(shù)目越多。培養(yǎng)板第一列是對照組沒有添加藥物，形成破

10、骨細(xì)胞最多;第二列加入的濃度為10-5mol/L紫杉醇，形成的破骨細(xì)胞最少;第三、四、五、六列加入紫杉醇的濃度分別為10-6、10-7、10-8、10-9mol/L，形成破骨細(xì)胞的數(shù)目依次增多，與第一列相比統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P＜0.05），說明紫杉醇對破骨細(xì)胞的形成和分化具有抑制作用。
　　 3、紫杉醇抑制破骨細(xì)胞的形成和分化是通過細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。重復(fù)3次的流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示:對照組的散點(diǎn)圖大部分均分布在Q3象限，以正常