TWEAK通過ERK1-2通路促進大鼠心肌成纖維細胞MMP2與Ⅰ型膠原表達.pdf

1、隨著經(jīng)濟的發(fā)展及生活水平的提高，心血管疾病的發(fā)病率在我國呈現(xiàn)逐步增長的趨勢。有數(shù)據(jù)表明，心血管疾病是全球慢性病死亡的主要病因，其中，高血壓與卒中和心肌梗死的發(fā)生密切相關(guān)。左心室肥厚作為高血壓病的靶器官損害之一，是多種心血管疾病的獨立危險因素，造成心律失常、心衰、猝死等不良預后。在左心室肥厚由代償轉(zhuǎn)變?yōu)槭Т鷥斏踔列乃ブ?，心肌纖維化發(fā)揮著重要作用。
　　心肌纖維化主要表現(xiàn)為間質(zhì)中膠原的合成增加和分解減少，膠原含量及結(jié)構(gòu)的細微改變即可影

2、響心室的僵硬度，進而影響心室的舒張功能。心肌組織中的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)主要由心肌成纖維細胞分泌，介導心肌細胞外基質(zhì)尤其是膠原的降解。MMPs的表達和活性增加，及與其抑制劑金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)的比例失衡是造成心肌纖維化的直接原因。有證據(jù)表明，MMP2通過降解膠原蛋白、降解細胞間連接、水解并

3、激活調(diào)控因子等機制促進心肌纖維化過程。
　　除了機械應力、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)外，炎癥在心肌纖維化的進程中也起到重要作用。炎性因子TNF超家族成員除了發(fā)揮對腫瘤的殺傷作用及促炎反應外，也參與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑(tumor necrosisfactor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)是TNF超家族成員，在多種細胞、組織及器官中均有表達。在心血管系統(tǒng)中，TWEAK

4、能通過促進心肌細胞肥大、介導內(nèi)皮細胞損傷、加速血管平滑肌細胞遷移、改變心肌細胞外基質(zhì)成分等機制參與心肌梗死、擴張性心肌病、高血壓等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程。TWEAK被報道能夠促進心肌成纖維細胞增殖及膠原合成，該過程由P38通路介導。P38通路與ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2)通路、JNK(c-jun n-terminalkinase)通路和ERK5通路同屬于絲裂原活化蛋白

5、激酶(mitogen-activated proteinkinase，MAPK)家族，廣泛存在于真核細胞內(nèi)。除P38通路外，ERK1/2通路被證實與心肌細胞肥大、心肌纖維化密切相關(guān)。因此，本研究旨在探索TWEAK能否通過ERK1/2通路調(diào)控心肌成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFs）Ⅰ型膠原及MMP2的表達，進一步揭示TWEAK促進心肌纖維化的作用機制。
　　目的:
　　研究腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑調(diào)

6、控大鼠心肌成纖維細胞表達基質(zhì)金屬蛋白酶2及Ⅰ型膠原的作用機制。
　　方法:
　　1.胰酶消化法分離培養(yǎng)新生大鼠原代CFs，免疫熒光法鑒定CFs。
　　2.利用Western blot法檢測磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的蛋白表達水平，從而確定重組人TWEAK(rhTWEAK)及ERK1/2通路抑制劑PD98059對CFs的最佳干預濃度及干預時間。
　　3.采用real-time PCR以及Western

7、blot法檢測干預后MMP2及Ⅰ型膠原的mRNA與蛋白表達水平。
　　4.采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測不同處理對細胞增殖的影響。
　　結(jié)果:
　　1.CFs呈梭形或不規(guī)則多角形，胞體較大，有折光性。胞漿透明，胞核呈卵圓形，無自發(fā)性搏動。波形蛋白免疫熒光顯示，細胞抗vimentin抗體表達為陽性。
　　2.TWEAK及抑制劑PD98059對ERK蛋白的作用:100μg/L TWEAK干預CFs顯著上調(diào)p-ER

8、K1/2的蛋白表達，并呈時間、劑量依賴性。PD98059阻斷ERK1/2通路后能抑制p-ERK1/2蛋白的表達，并且PD98059濃度在5μmol/L時達最大效應。
　　3.TWEAK及抑制劑PD98059對MMP2 mRNA與蛋白表達的調(diào)控:100μg/LTWEAK能顯著上調(diào)MMP2 mRNA與蛋白表達水平，5μmol/L PD98059阻斷ERK1/2通路后顯著抑制MMP2 mRNA與蛋白表達水平。
　　4.TWEAK及

9、抑制劑PD98059對Ⅰ型膠原mRNA與蛋白表達的調(diào)控:100μg/LTWEAK能顯著上調(diào)Ⅰ型膠原mRNA與蛋白表達水平，5μmol/L PD98059阻斷ERK1/2通路后顯著抑制Ⅰ型膠原mRNA與蛋白表達水平。
　　5.TWEAK及抑制劑PD98059對CFs增殖的影響:TWEAK能顯著促進CFs增殖，應用PD98059后能顯著抑制這一效應。
　　結(jié)論:
　　TWEAK可通過活化ERK1/2信號通路上調(diào)Ⅰ型膠原及M