大鼠矽肺差異蛋白的篩選及S100A8在矽肺纖維化中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本研究通過(guò)制備不同時(shí)期的矽肺大鼠模型，利用蛋白質(zhì)組學(xué)中的雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)，探討在不同時(shí)期矽肺大鼠肺組織中均呈明顯差異表達(dá)的蛋白種類，并挑選其中評(píng)分最高的一種蛋白（S100A8）在矽肺動(dòng)物模型和細(xì)胞水平加以驗(yàn)證，了解 S100A8與矽肺的相關(guān)性，為矽肺的發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：1、大鼠矽肺模型的復(fù)制：SPF級(jí)雄性 Wistar大鼠90只適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，隨機(jī)分為2組，模型組（即染矽塵組）60只、空

2、白對(duì)照組30只。模型組利用非暴露氣管法一次性灌注 SiO2懸液復(fù)制矽肺模型，空白對(duì)照組以滅菌生理鹽水替代。建模時(shí)間記為0周，于染塵后1周、2周、3周、4周、6周和8周6個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死模型組10只和空白對(duì)照組5只大鼠，同時(shí)肉眼觀察大鼠肺臟病理變化，迅速取出肺組織，大部分保存在液氮中備用，并將余下肺組織甲醛固定以鑒定造模是否成功及免疫組化檢查；2、矽肺差異蛋白的篩選：利用雙向電泳技術(shù)篩選矽肺的差異蛋白點(diǎn)，對(duì)所篩選的部分差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析；挑

3、選其中評(píng)分最高的差異蛋白S100A8進(jìn)行驗(yàn)證；3、矽肺差異蛋白的驗(yàn)證：①制作大鼠模型組和空白對(duì)照組肺組織的石蠟切片，免疫組織化學(xué)檢測(cè) S100A；②提取大鼠模型組和空白對(duì)照組的肺組織總蛋白及RNA；③再選SPF級(jí)雄性Wistar大鼠建立矽肺模型，支氣管肺泡灌洗獲取肺泡巨噬細(xì)胞，用 SiO2進(jìn)行刺激，18小時(shí)后收集上清液并保存；④體外肺纖維化模型的復(fù)制：胰酶消化法獲取肺成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)至第4代，用收集的SiO2刺激的巨噬細(xì)胞上清進(jìn)行刺激；

4、⑤制作細(xì)胞爬片，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)S100A8；⑥提取體外纖維化模型和空白空白對(duì)照組細(xì)胞的總蛋白及 RNA；⑦Western-blot法和實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)S100A8在大鼠矽肺模型和細(xì)胞水平不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況，應(yīng)用自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行圖像分析；4、應(yīng)用 SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較多組間均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：1、成功復(fù)制了大鼠矽肺模型；2、雙向電泳技術(shù)篩選出45個(gè)矽肺差異蛋白點(diǎn)，

5、選取其中7個(gè)點(diǎn)質(zhì)譜分析結(jié)果得到6個(gè)差異蛋白；3、免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)檢查：空白對(duì)照組 S100A8呈微弱表達(dá)，模型組 S100A8表達(dá)高于空白對(duì)照組，隨時(shí)間點(diǎn)增加而逐漸增強(qiáng)；4、Western-blot法檢測(cè)結(jié)果顯示S100A8在空白對(duì)照組呈弱表達(dá)，在大鼠矽肺模型和細(xì)胞水平中的表達(dá)均高于空白對(duì)照組且呈逐漸升高，且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；5、實(shí)時(shí)定量熒光 PCR檢測(cè)結(jié)果顯示S100A8在空白對(duì)照組呈弱表達(dá)，在大鼠矽肺模