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1、目的:本研究通過(guò)制備不同時(shí)期的矽肺大鼠模型,利用蛋白質(zhì)組學(xué)中的雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析技術(shù),探討在不同時(shí)期矽肺大鼠肺組織中均呈明顯差異表達(dá)的蛋白種類,并挑選其中評(píng)分最高的一種蛋白(S100A8)在矽肺動(dòng)物模型和細(xì)胞水平加以驗(yàn)證,了解 S100A8與矽肺的相關(guān)性,為矽肺的發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:1、大鼠矽肺模型的復(fù)制:SPF級(jí)雄性 Wistar大鼠90只適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,隨機(jī)分為2組,模型組(即染矽塵組)60只、空
2、白對(duì)照組30只。模型組利用非暴露氣管法一次性灌注 SiO2懸液復(fù)制矽肺模型,空白對(duì)照組以滅菌生理鹽水替代。建模時(shí)間記為0周,于染塵后1周、2周、3周、4周、6周和8周6個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死模型組10只和空白對(duì)照組5只大鼠,同時(shí)肉眼觀察大鼠肺臟病理變化,迅速取出肺組織,大部分保存在液氮中備用,并將余下肺組織甲醛固定以鑒定造模是否成功及免疫組化檢查;2、矽肺差異蛋白的篩選:利用雙向電泳技術(shù)篩選矽肺的差異蛋白點(diǎn),對(duì)所篩選的部分差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析;挑
3、選其中評(píng)分最高的差異蛋白S100A8進(jìn)行驗(yàn)證;3、矽肺差異蛋白的驗(yàn)證:①制作大鼠模型組和空白對(duì)照組肺組織的石蠟切片,免疫組織化學(xué)檢測(cè) S100A;②提取大鼠模型組和空白對(duì)照組的肺組織總蛋白及RNA;③再選SPF級(jí)雄性Wistar大鼠建立矽肺模型,支氣管肺泡灌洗獲取肺泡巨噬細(xì)胞,用 SiO2進(jìn)行刺激,18小時(shí)后收集上清液并保存;④體外肺纖維化模型的復(fù)制:胰酶消化法獲取肺成纖維細(xì)胞,培養(yǎng)至第4代,用收集的SiO2刺激的巨噬細(xì)胞上清進(jìn)行刺激;
4、⑤制作細(xì)胞爬片,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)S100A8;⑥提取體外纖維化模型和空白空白對(duì)照組細(xì)胞的總蛋白及 RNA;⑦Western-blot法和實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)S100A8在大鼠矽肺模型和細(xì)胞水平不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況,應(yīng)用自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行圖像分析;4、應(yīng)用 SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較多組間均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果:1、成功復(fù)制了大鼠矽肺模型;2、雙向電泳技術(shù)篩選出45個(gè)矽肺差異蛋白點(diǎn),
5、選取其中7個(gè)點(diǎn)質(zhì)譜分析結(jié)果得到6個(gè)差異蛋白;3、免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)檢查:空白對(duì)照組 S100A8呈微弱表達(dá),模型組 S100A8表達(dá)高于空白對(duì)照組,隨時(shí)間點(diǎn)增加而逐漸增強(qiáng);4、Western-blot法檢測(cè)結(jié)果顯示S100A8在空白對(duì)照組呈弱表達(dá),在大鼠矽肺模型和細(xì)胞水平中的表達(dá)均高于空白對(duì)照組且呈逐漸升高,且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);5、實(shí)時(shí)定量熒光 PCR檢測(cè)結(jié)果顯示S100A8在空白對(duì)照組呈弱表達(dá),在大鼠矽肺模
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