編碼弓形蟲SAG1，GRA2，GRA7和ROP16中多表位的DNA疫苗及其對BALB-c小鼠的免疫保護性研究.pdf

1、背景:剛地弓形蟲是一種專性細胞內(nèi)寄生的機會性致病原蟲，可感染包含人類、牲畜、海洋哺乳動物等在內(nèi)的大多數(shù)溫血動物，導致弓形蟲病的發(fā)生，嚴重影響公共健康。盡管在不同的國家和地區(qū)，剛地弓形蟲的感染率是不同的，但弓形蟲病的流行呈上升趨勢。因此，研制能夠預防和控制弓形蟲病的有效疫苗迫在眉睫。
　　目的:構(gòu)建弓形蟲多表位DNA疫苗及能表達細胞因子RANTES的重組載體作為疫苗佐劑，研究該多表位疫苗對感染急性弓形蟲病小鼠的免疫保護作用，評價RA

2、NTES基因佐劑對多表位DNA疫苗誘導小鼠免疫應答的調(diào)節(jié)及加強作用。
　　方法:首先利用生物信息學軟件和網(wǎng)絡在線預測工具預測弓形蟲SAG1，GRA2，GRA7和ROP16四種抗原的T細胞表位和B細胞表位，篩選出12個優(yōu)勢表位，經(jīng)人工合成編碼多表位的基因片段MEG(Multi-epitope Gene)，利用分子生物學技術與方法，構(gòu)建了T-A克隆載體。經(jīng)過正確的鑒定，將回收純化的目的片段MEG亞克隆至表達載體pEGFP-C1中，構(gòu)建

3、了重組表達質(zhì)粒pEGFP-TgMEG(pTgMEG)。利用RT-PCR技術擴增小鼠脾臟內(nèi)活化T細胞表達與分泌調(diào)節(jié)因子RANTES基因，構(gòu)建T-A克降載體，經(jīng)過正確的鑒定，將回收純化的目的片段RANTES亞克隆至真核表達載體pEGFP-C1中，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pEGFP-RANTES(pRANTES)。構(gòu)建的兩個重組表達質(zhì)粒經(jīng)過一系列的鑒定均正確后，將其轉(zhuǎn)到HEK293T細胞中進行體外表達，熒光顯微鏡下觀察目的蛋白的表達情況;通過SDS

4、-PAGE和Western blotting兩種實驗技術檢測目的蛋白的活性情況。然后大量提取兩種重組質(zhì)粒分別制備疫苗和佐劑，經(jīng)肌肉注射免疫接種BALB/c小鼠，檢測小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的細胞免疫與體液免疫反應;用1000個弓形蟲RH株速殖子腹腔感染小鼠，進行攻擊實驗，觀察小鼠的發(fā)病情況，記錄小鼠的生存時間。最后根據(jù)實驗數(shù)據(jù)來分析疫苗和佐劑的免疫保護作用。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了重組表達載體pTgMEG和pRANTES，經(jīng)PCR、酶切和DNA

5、測序鑒定正確，各目的基因片段完整準確地連接到表達載體pEGFP-C1上。將pTgMEG和pRANTES瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，在熒光顯微鏡下均可觀察到蛋白的表達，然后經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting驗證均為目的蛋白。動物實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，多表位DNA疫苗pTgMEG組的小鼠產(chǎn)生更高水平的抗弓形蟲IgG、IgG2a、IFN-γ和CD8+/CD4+，另外小鼠的平均存活時間也顯著延長;而且基因佐劑pEGFP-