基于微流控芯片骨質(zhì)疏松模型的建立及治療.pdf

1、目的:
　　骨形成的減少和骨吸收增加與骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展密不可分。成骨細(xì)胞作為骨形成的重要基礎(chǔ)細(xì)胞，其凋亡與活性降低與骨質(zhì)疏松的形成息息相關(guān)。糖皮質(zhì)激素作為臨床上常用的抗炎藥物對(duì)全身骨骼系統(tǒng)有嚴(yán)重的損傷作用。本實(shí)驗(yàn)以微流控技術(shù)為主要手段，體外構(gòu)建糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型并對(duì)其進(jìn)行治療。通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察找出最適誘導(dǎo)濃度，為臨床研究骨質(zhì)疏松提供重要基礎(chǔ)。
　　方法:
　　芯片的設(shè)計(jì)與制作由大連化學(xué)物理研究采用軟蝕刻方法制作

2、而成。以聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)作為芯片制作材料。通過(guò)等離子處理將PDMS（通道面）與玻璃片（細(xì)胞培養(yǎng)面）進(jìn)行不可逆封接。選用小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞系作為基礎(chǔ)細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，利用灌流裝置對(duì)芯片內(nèi)的誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞進(jìn)行時(shí)間為24h、速度為0.1μl/min的藥物灌流處理，以此構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型，實(shí)驗(yàn)組設(shè)置:一，地塞米松(Dexamethasone，Dex)單獨(dú)灌流組;二，

3、氯化鋰(LiCl)單獨(dú)灌流組;三，氯化鋰預(yù)處理，地塞米松和氯化鋰同時(shí)灌流組。并根據(jù)芯片本身濃度梯度產(chǎn)生的特點(diǎn)計(jì)算出各通道內(nèi)藥物濃度。根據(jù)骨質(zhì)疏松發(fā)生機(jī)制，檢測(cè)成骨細(xì)胞的凋亡程度及堿性磷酸酶活性。采用熒光染色的方法分析糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡情況，利用組織染色法檢測(cè)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性。用Image-pro Plus6.0對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析，分別分析不同藥物濃度下細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量變化、凋亡情況、堿性磷酸酶活性。并用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟

4、件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　(1)微流控芯片的制備
　　整個(gè)芯片通道包括上面的濃度梯度形成(concentration gradientgenerator, CGG)部分和下面的細(xì)胞培養(yǎng)部分。濃度梯度的設(shè)計(jì)是根據(jù)Noo Li Jeon等人的研究，當(dāng)兩種液體沿濃度梯度通道下行時(shí)，每種液體都將在節(jié)點(diǎn)處分流然后與周圍的液流以層流的方式合并，然后在蜿蜒的通道內(nèi)混合，最后在濃度梯度輸出口形成一系列濃。據(jù)現(xiàn)階段研究，本實(shí)驗(yàn)

5、芯片上兩個(gè)進(jìn)液孔的液體濃度分別是0和10μmol/L，那么根據(jù)公式，這六個(gè)輸出口的濃度將分別是0、2、4、6、8和10μmol/L。細(xì)胞培養(yǎng)部分由六個(gè)培養(yǎng)池組成并與濃度梯度形成部分相結(jié)合，每個(gè)培養(yǎng)池的大小為:長(zhǎng)1200μm，寬1200μm，高150μm，容積大約為2μL。成骨細(xì)胞通過(guò)進(jìn)液孔和通道到達(dá)培養(yǎng)池，貼壁后用于實(shí)驗(yàn)。
　　(2)地塞米松和LiCl對(duì)成骨細(xì)胞增殖及活性影響
　　地塞米松灌流后通道2-6(C2-C6)內(nèi)成骨

6、細(xì)胞的形態(tài)由原來(lái)的梭形或纖維狀逐漸變成圓形或橢圓形，其增殖及活性也有明顯的下降(P＜0.05)，且增殖速率隨地塞米松濃度的增加而減小，到C4通道時(shí)細(xì)胞開(kāi)始成負(fù)增長(zhǎng)。而LiCl灌流后對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量、增殖速度及活性均無(wú)影響。
　　(3)地塞米松和LiCl對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響
　　地塞米松灌流后的成骨細(xì)胞出現(xiàn)凋亡狀態(tài)，包括線粒體膜電位、細(xì)胞核形態(tài)、質(zhì)膜通透性均有所改變(P＜0.05)且隨著地塞米松濃度的增加凋亡愈加明顯。而Li

7、Cl灌流后的成骨細(xì)胞則沒(méi)有出現(xiàn)凋亡狀況。
　　(4)地塞米松和LiCl對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響
　　地塞米松灌流后的成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性出現(xiàn)降低(P＜0.05)，且隨著濃度的增加其活性越來(lái)越低。LiCl灌流后的成骨細(xì)胞則沒(méi)有出現(xiàn)上述狀況。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)以微流控技術(shù)為平臺(tái)，成骨細(xì)胞為基礎(chǔ)，利用糖皮質(zhì)激素體外構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型及對(duì)其進(jìn)行治療。以此對(duì)骨質(zhì)疏松的發(fā)病進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)最佳地塞米松誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松形