RFLP-微流控芯片技術(shù)基因突變檢測系統(tǒng)的建立.pdf

1、腫瘤是威脅人類健康的重大疾病，發(fā)病率逐年上升。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中會涉及多種基因的突變，因此突變基因的檢測是腫瘤研究的重要課題，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷和治療。目前測序是檢測基因的金標(biāo)準(zhǔn)，然而其耗時長價格昂貴等缺陷，不適合大規(guī)模篩查的需要，為此人們發(fā)展了相對簡捷的方法進(jìn)行測序前的檢測。目前，常用的突變檢測方法有PFLP(限制性片段長度多態(tài)性)、SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析)、HA(雜合雙鏈分析法)、ASA(等位基因特異性擴(kuò)增法)、DHPLC

2、(變性高效液相色譜)、MI(微衛(wèi)星不穩(wěn)定性)等，其中PCR-RFLP是一種以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)進(jìn)行特異性酶切從而實(shí)現(xiàn)對基因點(diǎn)突變進(jìn)行檢測的方法，具有操作簡單并且重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合電泳可有效檢測突變，應(yīng)用十分廣泛。但常規(guī)的電泳技術(shù)靈敏度相對較低，檢測的假陰性率相對較高，不能對微量的突變樣品進(jìn)行有效篩查。 微流控芯片分析系統(tǒng)是分析化學(xué)、微機(jī)電加工、計(jì)算機(jī)、電子學(xué)、材料科學(xué)以及生物學(xué)等多學(xué)科交叉的產(chǎn)物，其目的是通過分析儀器的微型化和集

3、成化，極大限度地把分析實(shí)驗(yàn)室的功能轉(zhuǎn)移到便攜的分析設(shè)備中，甚至集中到方寸大小的芯片上，因此又被稱為微全分析系統(tǒng)(uTAS)或芯片實(shí)驗(yàn)室(LOC)。微流控芯片具有樣品用量少、分析速度快，靈敏度高，易于集成化自動化的特點(diǎn)，在生物樣品的分析中有著顯著的優(yōu)勢。 微流控電泳芯片分析系統(tǒng)是在毛細(xì)管電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來的更為優(yōu)化的分析技術(shù)。其原理是以電場為驅(qū)動力，借助于離子或分子在電泳遷移或分配上的差異，從而實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜試樣中多種組分的分離。由于

4、芯片的微通道面積-體積比顯著增大，焦耳熱能很快向四周溢散，所以可施加平板凝膠電泳難以達(dá)到的高場強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)對樣品快速、高效的分離檢測。目前在芯片上已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對核酸，蛋白質(zhì)，氨基酸等多種生物分子的分析與分離，并有效用于多種基因突變的檢測。 大腸癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，在我國已位居第3位，由于就診時多為中晚期，導(dǎo)致死亡率明顯增加，因此建立有效的早期檢測的方法，以實(shí)現(xiàn)早期診斷、早期治療是提高患者生存率的關(guān)鍵。大腸癌的發(fā)生與發(fā)展是一個

5、多階段、多個相關(guān)基因改變的累積過程，其中K-ras基因突變發(fā)生在腺瘤早期，對其檢測有助于大腸癌的早期診斷。本研究擬以K-ras基因突變作為檢測對象，將RFLP方法中的電泳檢測過程移植于到微流控芯片上進(jìn)行，建立RFLP-微流控基因突變檢測系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對K-ras基因突變的高效快速檢測。 材料與方法: 一、微流控電泳芯片DNA分離系統(tǒng)的建立 1、芯片的制作用標(biāo)準(zhǔn)光刻和濕法刻蝕技術(shù)在玻璃基片上刻蝕出十字形微通道網(wǎng)絡(luò)，采用

6、熱鍵合方法將其與蓋片進(jìn)行封接，在微通道末端粘接儲液池，制成玻璃微流控芯片。 2、共聚焦型激光誘導(dǎo)熒光檢測裝置的建立。 3、芯片通道表面的修飾。 4、微流控電泳芯片DNA分離系統(tǒng)的優(yōu)化 (1)緩沖液組成成分的優(yōu)化：常規(guī)選取1XTBE，2XTBE及3XTBE作為緩沖液，考察緩沖液對篩分系統(tǒng)的影響。 (2)篩分介質(zhì)場強(qiáng)的優(yōu)化：在相同篩分濃度下，考察不同場強(qiáng)120V/cm、180V/cm、240V/cm對

7、分離效能的影響； (3)篩分系統(tǒng)濃度的優(yōu)化：在相同的180V/cm場強(qiáng)下，考察不同濃度篩分介質(zhì)1.0％、2.0％、3.0％HPC對篩分效能的影響。 二、RFLP-微流控芯片基因突變檢測系統(tǒng)的建立 1、PCR-RFLP方法考察 經(jīng)PCR擴(kuò)增出含有密碼子12位點(diǎn)的107bpDNA片段，利用Mav Ⅰ限制性內(nèi)切酶特異性切割目的基因。瓊脂糖電泳及微流控電泳芯片的檢測結(jié)果對比。 2、檢測系統(tǒng)靈敏度考察

8、 分別稀釋酶切樣本至50倍、100倍、200倍和300倍、400倍、500倍，600倍，微流控芯片對各濃度檢測，考察芯片檢測靈敏度情況。根據(jù)K-ras基因12密碼子突變與否，分別按不同比例混合突變型SW480和野生型HT29細(xì)胞(1：1、1：10、1：100、1：103、1：104、1：105、1：106)利用微流控芯片檢測結(jié)果，并以常規(guī)電泳為對照比較對混合細(xì)胞檢測突變的限度。 三、RFLP-微流控芯片基因突變檢測系統(tǒng)的應(yīng)用

9、 1、對6種大腸癌細(xì)胞系進(jìn)行檢測。 2、對46例大腸癌患者臨床樣本進(jìn)行檢測，考察微流控芯片的篩分系統(tǒng)與傳統(tǒng)電泳相比對樣本的檢出率。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、微流控芯片DNA分離系統(tǒng)的優(yōu)化 1、微流控芯片通道表面修飾 經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)MES(pH6.1)酸性緩沖液對芯片的表面-SiOH基團(tuán)的酸化處理后能有效抑制電滲流的產(chǎn)生，減輕譜帶擴(kuò)展現(xiàn)象，使芯片前期處理時間明顯縮短。 2、緩沖液組成的選擇

10、 選取1XTBE，2XTBE及3XTBE作為緩沖溶液，實(shí)驗(yàn)證明在相同篩分介質(zhì)的濃度下，隨著緩沖液濃度增加分離度越好，對酶切樣本檢測的敏感度越提高，但緩沖液濃度增大分離時間也相應(yīng)的增加，因此選取3XTBE作為緩沖液。 3、篩分介質(zhì)濃度的優(yōu)化 在相同的場強(qiáng)下，隨篩分介質(zhì)濃度的增加分離效能越好但粘滯度越大，分離時間越長，實(shí)驗(yàn)證明2％HPC可以達(dá)到較好的篩分效果且粘滯度小容易充入微通道。 4、篩分系統(tǒng)場強(qiáng)的優(yōu)化

11、 在相同的篩分濃度下，隨著場強(qiáng)的增加其分離時間縮短，但分離度也隨之下降。180V/cm的場強(qiáng)可在10min左右有效分離φX174-HaelIIRF DNA。 二、RFLP-微流控芯片基因突變檢測系統(tǒng)的建立 1、PCR-RFLP方法的考察 針對K-ras基因12密碼子的野生型和突變型細(xì)胞系進(jìn)行PCR-RFLP反應(yīng)，擴(kuò)增出107bpDNA片段后進(jìn)行特異性酶切，野生型細(xì)胞被完全切斷為77bp和30bp，而突變型則無變

12、化。 2、微流控芯片敏感度檢測 稀釋酶切樣本，500倍時樣本在微流控芯片中峰仍清晰可見，經(jīng)傳統(tǒng)電泳對比其敏感度提高500倍以上。 按不同比例混合的K-ras基因12密碼子突變型和野生型細(xì)胞的檢測，經(jīng)微流控芯片分析細(xì)胞混合比例的突變檢測限度達(dá)1：10000，常規(guī)電泳僅可在1：10見一模糊條帶，而測序檢測限度僅為1：4。 三、RFLP-微流控芯片基因突變檢測系統(tǒng)的應(yīng)用 1、RFLP-微流控芯片系統(tǒng)對6

13、種大腸癌細(xì)胞系的檢測結(jié)果完全符合測序檢測的突變類型。 2、臨床樣本的檢測：取大腸癌標(biāo)本46例，經(jīng)微流控芯片檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致，其中有兩例大腸癌臨床樣本在微流控芯片檢測系統(tǒng)中顯示突變，而測序與常規(guī)電泳無顯示。 結(jié)論： 本研究采用MES(pH6.1)弱酸性緩沖液動態(tài)處理結(jié)合弱酸性基質(zhì)靜置動態(tài)涂層方法處理玻璃芯片，成功建立了微流控芯片DNA分離系統(tǒng)并實(shí)現(xiàn)了對φX174-HaelIIRF DNA進(jìn)行有效分離。RFLP