重組桿狀病毒表達(dá)SVCV G蛋白及其轉(zhuǎn)導(dǎo)魚類細(xì)胞的研究.pdf

1、鯉春病毒血癥病毒(Spring Viremia0fCarp Vh'us,SVCV)屬于彈狀病毒科水泡性病毒屬中的一員,該病毒可引起鯉魚爆發(fā)鯉春病毒血癥(Spring Viremia of Carp,SVC)。囊膜糖蛋白(G)是SVCV最主要的免疫原性蛋白,是疫苗和診斷試劑研制的重要靶蛋白。本研究將連有SVCV G蛋白(SVCV/G)基因的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-SVCV/G轉(zhuǎn)化進(jìn)含穿梭載體Bacmid的感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac中,

2、獲得重組子rBacmid-SVCV/G。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將該重組子轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞,獲得重組桿狀病毒Bac-SVCV/G。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SVCV/G可介導(dǎo)昆蟲細(xì)胞發(fā)生融合,通過間接免疫熒光證明,SVCV/G蛋白表達(dá)在昆蟲細(xì)胞膜上。前人研究發(fā)現(xiàn),水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的G蛋白(VSV/G)同樣可以表達(dá)在昆蟲細(xì)胞膜上并可介導(dǎo)昆蟲細(xì)胞融合。為比較SVCV/G與VSV/G介導(dǎo)的細(xì)胞融合,以及便于

3、桿狀病毒滴度的測定,本研究構(gòu)建了三個重組桿狀病毒Bac-SVCV/G-CMV-EGFP、Bac-VSV/G-CMV-EGFP、Bac-CMV-EGFP,并用間接免疫熒光和Western blot檢測了SVCV/G的表達(dá)。通過比較SVCV/G與VSV/G介導(dǎo)的昆蟲細(xì)胞融合,證實(shí)了SVCV/G可介導(dǎo)更加顯著的細(xì)胞融合。
　　 桿狀病毒能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞,現(xiàn)已成為一種新型的基因?qū)胼d體。本研究利用含有巨細(xì)胞病毒極早期基因(Cyto

4、megalovirus immediate-early,CMV-IE)啟動子及其下游增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)報(bào)告基因的重組桿狀病毒Bac-CMV-EGFP,分別轉(zhuǎn)導(dǎo)了6種魚類細(xì)胞系,并利用流式細(xì)胞儀檢測了重組桿狀病毒對魚類細(xì)胞系的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。研究發(fā)現(xiàn),該重組桿狀病毒可以高效轉(zhuǎn)導(dǎo)魚類細(xì)胞,特別是鯉魚上皮瘤(EPC)細(xì)胞和胖頭鯉肌肉(FHM)細(xì)胞,轉(zhuǎn)導(dǎo)效率幾乎為100

5、％,對大馬哈魚胚胎細(xì)胞(CHSE-214)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高,其次是草魚腎臟(CIK)細(xì)胞和斑點(diǎn)叉尾鮰卵巢(CCO)細(xì)胞,對虹鱒性腺(RTG.2)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率雖不高,但發(fā)現(xiàn)也可以被轉(zhuǎn)導(dǎo)。同時(shí),本研究還發(fā)現(xiàn),報(bào)告基因在EPC細(xì)胞中的表達(dá)能夠持續(xù)存在至少80天,說明桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)EPC細(xì)胞后,不僅可以實(shí)現(xiàn)外源基因的高效導(dǎo)入,而且還可以使外源基因穩(wěn)定、高量的表達(dá)。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)以生長培養(yǎng)基作為桿狀病毒孵育液比以PBS作為孵育液能夠更有效的