嗜熱細(xì)菌木糖異構(gòu)酶的分子改造及纖維堆囊菌xylA的克隆與表達(dá).pdf

1、燃料乙醇是最有發(fā)展前景的新型可再生能源，其生產(chǎn)和應(yīng)用因在經(jīng)濟(jì)發(fā)展和戰(zhàn)略安全上的重大意義，越來越受到各國政府的重視。自然界中含有豐富的植物纖維資源，而目前只有3-4％的植物纖維資源被有效地利用。木糖是木質(zhì)纖維素水解物中含量僅次于葡萄糖的一種單糖，實(shí)現(xiàn)木糖轉(zhuǎn)化乙醇是纖維素乙醇生產(chǎn)需要解決的難題之一。 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是傳統(tǒng)上食品及化工工業(yè)的最佳生產(chǎn)菌株，在工業(yè)生產(chǎn)中有上百年的酒類發(fā)酵應(yīng)用

2、歷史，具有乙醇產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)等許多優(yōu)良特性，是乙醇工業(yè)生產(chǎn)的首選菌株。然而釀酒酵母菌缺乏轉(zhuǎn)化木糖生成木酮糖的酶而不能利用木糖，但能利用木糖的異構(gòu)體形式——木酮糖。 根據(jù)代謝途徑工程理論，采用代謝流擴(kuò)增和底物譜拓展的所謂“加法戰(zhàn)略”，重組表達(dá)木糖向木酮糖轉(zhuǎn)化所需的相關(guān)酶基因，是在釀酒酵母中建立木糖代謝途徑的有效措施。木糖異構(gòu)酶(xylose isomerase XI)能直接轉(zhuǎn)化木糖生成木酮糖，不需要任何輔因子，被認(rèn)為是在釀酒

3、酵母建立木糖代謝的首選途徑。但迄今為止只有三種來源的木糖異構(gòu)酶基因xylA在釀酒酵母中得到活性表達(dá)，由于它們?cè)诮湍赴l(fā)酵溫度30℃條件下的酶活性相對(duì)比較低，還不能適應(yīng)乙醇發(fā)酵的要求。 本論文主要包括兩個(gè)方面，一方面對(duì)已經(jīng)在釀酒酵母中得到活性表達(dá)的嗜熱細(xì)菌Thermus thermophilus木糖異構(gòu)酶XI進(jìn)行分子改造，以提高其在酵母發(fā)酵溫度下的酶活性：另一方面，克隆中溫型嗜纖維素粘細(xì)菌纖維堆囊菌Sorangiumcellul

4、osum的木糖異構(gòu)酶基因xylA并在釀酒酵母中得到活性表達(dá)。 在相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)一系列木糖異構(gòu)酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)分析了T thermophilus木糖異構(gòu)酶的三維結(jié)構(gòu)；選擇兩個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)Pro137和Asp247突變成Gly。通過定點(diǎn)突變獲得三個(gè)突變體XI137(Pro137Gly)、XI2417(Asp247Gly)、XI137247(Pro137Gly，Asp247Gly)，并構(gòu)建表達(dá)載體XM20

5、4-XI137、XM204-X12417和XM204-XI137247，轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室釀酒酵母H158，得到重組菌株H158-XI137、H158-X1247和H158-XI137247，然后對(duì)重組菌株進(jìn)行酶活性分析。結(jié)果顯示：相對(duì)于野生型的XI，突變體XIl37、X1247和XI137247中溫條件下的酶活性有所提高，特別30℃的酶活比原初XI提高一倍：最適pH范圍有很大的拓展，在pH6.0-9.0之間都能表現(xiàn)出很高的酶活性；但是，突變體

6、X1137和X1137247的熱穩(wěn)定性有很大的降低。這些表明，嗜熱細(xì)菌木糖異構(gòu)酶的137位Pro對(duì)其熱穩(wěn)定性和最適pH起到很大的作用；而247位的Asp的作用不明顯。為Pro在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮的作用提供了又一證據(jù)，也獲得了中溫下酶活性稍高的突變體，從理論和應(yīng)用兩方面取得了一定的進(jìn)展。在對(duì)嗜熱細(xì)菌XI分子改造的同時(shí)，克隆得到纖維堆囊菌(S.cellulosum)157-2的木糖異構(gòu)酶基因xylA并在釀酒酵母中得到活性表達(dá)。通過對(duì)系列木糖異

7、構(gòu)酶核苷酸和蛋白質(zhì)序列分析得到木糖異構(gòu)酶基因的同源序列，設(shè)計(jì)簡并引物擴(kuò)增得到分子探針片斷，利用此分子探針對(duì)Bamhi和SalI完全酶切的纖維堆囊菌157-2基因組DNA進(jìn)行雜交，并獲得特異性雜交片段B1800、B5500、S2000和S2500：然后經(jīng)過片段自連，利用反向PCR擴(kuò)增得到S2500的反向片段，測序并進(jìn)行拼接和生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)引物克隆得到長1332bp，編碼433個(gè)氨基酸的開放閱讀框，確認(rèn)為纖維堆囊菌157-2的木糖異構(gòu)