嗜熱真菌糖苷酶的基因克隆、表達(dá)與分子改造.pdf

1、纖維素是地球上最豐富的碳水化合物，可被纖維素酶降解轉(zhuǎn)化成為葡萄糖，對(duì)于人類社會(huì)解決能源危機(jī)、食物短缺和環(huán)境污染具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。傳統(tǒng)上采用化學(xué)方法控制纖維素降解難度大、成本高，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，而纖維素的生物降解有效克服了這些問題。纖維素酶是一類能夠水解纖維素β-D-糖苷鍵生成葡萄糖的多組分酶的總稱，纖維素的徹底降解需要內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三種組分的協(xié)同作用，β-葡萄糖苷酶是纖維素酶解的瓶頸。在纖維素水解時(shí)，增加β

2、-葡萄糖苷酶活性，會(huì)有效提高纖維素酶解效率。近些年來，許多專家學(xué)者通過分子生物學(xué)等手段不斷提高酶活力和獲得新性能的重組纖維素酶。
　　 糖化酶是一種具有外切活性的酶，它能從非還原性末端水解淀粉、糊精、糖原等的α-1，4-葡萄糖苷鍵，得到終產(chǎn)物β-D-葡萄糖，是淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖過程中的主要酶類之一。糖化酶已在釀造、食品、醫(yī)學(xué)等工業(yè)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，具有重要商業(yè)價(jià)值。但市場應(yīng)用的糖化酶主要來源于常溫菌，因其酶活力和產(chǎn)率低

3、，熱穩(wěn)定性差導(dǎo)致產(chǎn)品成本高，儲(chǔ)存期短，而制約糖化酶在農(nóng)業(yè)、工業(yè)上的應(yīng)用。由此可見，熱穩(wěn)定性糖化酶的研究和開發(fā)具有重要意義。
　　 疏綿狀嗜熱絲孢菌（Thermomyces lanuginosus）和嗜熱毛殼菌（Chaetomiumthermophilum CT2）是廣泛分布的，生長上限溫度較高的嗜熱真菌，從這兩種真菌中已分離了多種嗜熱酶，具有極大的研究和應(yīng)用價(jià)值。本研究通過RT-PCR和RACE-PCR從嗜熱毛殼菌中首次分離到了

4、一個(gè)新的β-葡萄糖苷酶基因，GenBank登錄號(hào)為EF648280，序列分析表明該基因全長核酸序列為3213 bp，包含一個(gè)2604 bp的開放閱讀框ORF，編碼867個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，酵母表達(dá)后酶蛋白表達(dá)量為1.644 U/mg，經(jīng)硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換等步驟純化了該重組蛋白，SDS-PAGE顯示該重組蛋白大小約為119 kDa，比推測的蛋白分子量稍大，可能與該蛋白的糖基化有關(guān)。重組酶的

5、最適反應(yīng)溫度和最適pH值分別為60℃和5.0，該酶具有較高的熱穩(wěn)定性，70℃保溫10min后剩余酶活為29.7％。
　　 本研究還從疏綿狀嗜熱絲孢菌中克隆到一種糖化酶基因（GenBank登錄號(hào)為EF545003）并將其在畢赤酵母中進(jìn)行了高效表達(dá)，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后酶活最高可達(dá)11.6U/mL，經(jīng)硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換等步驟純化了該重組蛋白，SDS-PAGE顯示該重組蛋白大小約為67

6、kDa，該重組酶的最適反應(yīng)溫度和最適pH值分別為60℃和.5.0，在pH4.0-9.0的范圍內(nèi)是很穩(wěn)定的。
　　 對(duì)來自嗜熱毛殼菌的β-葡萄糖苷酶基因的非保守氨基酸和保守氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變。三個(gè)非保守氨基酸的突變?yōu)镵275R、N276S和279D，表達(dá)篩選后發(fā)現(xiàn)與原始菌GS-BGL相比，三個(gè)突變子的酶活都有不同程度的降低，突變子的酶活分別是原始菌酶活的81.3％、63％和65％，但最適反應(yīng)溫度均提高了5℃；突變子N276S和G2

7、79D的最適pH由5變?yōu)?，而突變子K275R最適pH值仍保持在5；在熱穩(wěn)定性方面，三個(gè)突變子表現(xiàn)不同，60℃處理60 min，突變子G279D穩(wěn)定性提高最多，仍有80.6％的酶活，突變子N276S穩(wěn)定性次之，酶活剩余72.1％，原始酶僅剩69.55％的活性，而突變子K275R酶活剩余59.5％，與原始酶相比穩(wěn)定性下降。而當(dāng)保守氨基酸第287位的天冬氨酸突變?yōu)榉怯H核的甘氨酸后，突變子失去了糖苷水解酶的活性，證明了該氨基酸為維持水解酶活性

8、的必需氨基酸，但目前還沒有檢測到糖苷合成酶的活性。
　　 由于定點(diǎn)突變主要是針對(duì)天然酶蛋白中少數(shù)的氨基酸殘基進(jìn)行替換，蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)基本保持不變，而且本研究中的β-葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)迄今為止還沒有報(bào)道，因而對(duì)酶蛋白的改造有限。為了提高β-葡萄糖苷酶的酶活力和穩(wěn)定性，采用定向進(jìn)化的方法對(duì)β-葡萄糖苷酶的基因進(jìn)行改造。本研究以β-葡萄糖苷酶bgl基因?yàn)槌霭l(fā)基因，采用易錯(cuò)PCR的方法建立突變體文庫，以高活力為篩選壓力，篩選方法采用平板熒

9、光初篩和小量發(fā)酵法相結(jié)合。經(jīng)過突變和篩選，獲得了一個(gè)酶活力提高0.74倍的突變體，序列測定表明：突變基因與出發(fā)基因比較，突變子BE857有6個(gè)氨基酸發(fā)生了變化。通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子層析等步驟純化了該蛋白，酶學(xué)性質(zhì)與出發(fā)酶進(jìn)行了比較，該突變酶的最適溫度為65℃，比出發(fā)酶提高了5℃，最適pH與出發(fā)酶一致均為5.0，在穩(wěn)定性方面，突變子株BE857有所提高，60℃處理1h后酶活仍剩余75.58