一株產纖維素酶的耐熱煙曲霉篩選及產酶條件研究

1、研究報告中國釀造2012鼉霎；：翥尹6期61一株產纖維素酶的耐熱煙曲霉篩選及產酶條件研究金偉1，陳文靜1，姚斌2，曾馳，繆禮鴻h，梅雪臣(1武漢工業(yè)學院生物與制藥工程學院，湖北武漢430023；2中國農業(yè)科學院飼料研究所，北京100081)摘要：從土壤中分離和篩選到l株產纖維素酶能力較強的耐熱真菌E4。通過菌株的形態(tài)特征和18srDNA序列同源性比較，該菌株被鑒定為一種煙曲霉(Aspe倒JIJs如刪gan曲。實驗結果表明，該菌株能在20

2、℃以下生長，其最適和最高生長溫度分別為40℃和55℃。該菌株的最佳產纖維素酶的基質為稻草，其最適產酶pH值為50，最適產酶溫度為42℃。50℃搖瓶培養(yǎng)72h時可達到產酶最高峰，其羧甲基纖維素酶(CMCase)活和濾紙酶(FpA)活分別達到35IJ／mI，和32u／InL。該菌株對稻草的降解效果較好，45℃液體搖床培養(yǎng)條件下在7d內對天然稻草的降解率達635％。關鍵詞：煙曲霉：耐熱真菌；纖維素酶；篩選中圖分類號：Q93—331文獻標識碼：

3、A文章編號：0254—5071(2012)06一0061一04Scrceningofalhe加10tol咖tceUlll勰ep川ucingA印e喀珊璐危m咖t哪s姚andstIldyonthecon螄。地forcellIllasep】『0ducdon刪We—C臟NWe蛐91，YA0Bin2，皿NGChil，MnOmong“，ⅧIxuechenl(1sch00lofBiology蛆dPh覆nnaceubcalEngilleemg，wtIl

4、laIlPolytechicU_niversi畎W曲髓430023，Chil峨2Feed鼬seafchksti蛐eChineseA舒culturalsciencesBe啦g100081Ch㈣Ab曲噎ct：Am鋤ot01e啪tcellulaseproducingmngals打ainE4wasisolated丘om也esoilE4wasidentifiedasAsp喇jjus向nligatusbymorpholo西一calchamcteri

5、stics勰well弱by出e18SrIⅨAgenesequenceExperimentalresultsshowthatitcang渤Ⅳat20℃，鋤dtheoptinl啪翹dsupremegrowllltenlpemturew弘40℃and55℃，respectivelyThebestenz嚴eproductioncondmonsiss咖asfel脅en協(xié)tionmediuIns111eop吐眥len巧mcproductionpHw

6、豁5O，aDdthetemperatureis42℃Tllema)【iIIl啪cMcase(hydroxylmetllylcelluloseen巧me)actiV時is35Lf／InL，andthema)【im哪FPA(filterpaperenz歸e)acti啦is32IⅣmLafterferInen硼on州thshakingnaskfor72hat45℃Thes廿aincoulde疏ctivelydegmdate曲s廿aw蛐d也ed

7、egmationmtereached635％in7dKeywords：cellllloseen2亨me；thermotolemt如n舀；screeIling纖維素類物質占植物干50‰是地球上分布最廣、含量最豐富的碳源物質。微生物對纖維素的降解轉化是自然界中碳索循環(huán)的主要環(huán)節(jié)，因此研究微生物對纖維的降解具有重要意義，其中絲狀真菌是研究最多的纖維素降解類群【”，在我國，大量秸稈往往被就地直接焚燒，不但污染了環(huán)境，而且造成秸稈資源的浪費。近年

8、來，雖然開發(fā)出一些新的秸稈利用技術，但是由于技術瓶頸，秸稈的利用仍然存在轉化利用率低、時間長、成本偏高等問題【2】。從高效和環(huán)保的角度出發(fā)，纖維素被徹底降解而不會對環(huán)境造成污染的一條有效途徑便是利用纖維素酶的水解作用。真菌被認為是自然界中纖維素的主要分解者，其中高溫真菌可能產生具有耐高溫的分解纖維素的酶而受到關注【3】。馬懷良【41等篩選的高溫細菌HB4和高溫霉菌Ⅷ證，其中高溫霉菌帥A酶活最高為10535n7／mI，。劉長莉等闊用纖維素

9、分解菌復合系NSC7，其內切酶及總纖維素酶活為448U／mL和751U／mL，能夠在5d內分解552％天然稻稈。趙方圓舊等報道的纖維素降解菌曲霉YNl總纖維素酶活力為266I『／mI，，在7d內能夠分解4187％的稻草。張楠等同篩選到降解纖維素的高溫曲霉，7d內對煙桿的降解率最高可達422％。本文報道了一株具有較高纖維素酶活性的高溫真菌篩選及其培養(yǎng)條件對纖維素酶活的影響。1材料與方法11材料111菌種本研究菌種是從武漢市和廈門市周邊地區(qū)

10、富含纖維素的土壤中篩選獲得。112培養(yǎng)基(1)富集培養(yǎng)基：取509固體稻草，(NH。)2SO。49，Ⅺ12P0429，MgS047H20059，h恤S04059，蒸餾水1000InL，pH40～50。(2)羧甲基纖維素瓊脂培養(yǎng)基(初篩培養(yǎng)基)：羧甲基纖維素鈉lOg，Q町H≯2s0449，KH2P0t29，MgS04‘7H20059，MnS04059，瓊脂209，蒸餾水1000IIlL，pH4肚50。(3)復篩液體培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉1

11、09，Q叮H≯：SO。49，Ⅺ2P0429，MgS047H20059，MnS04059，蒸餾水1000lnL，pH40～50，分裝lO個250mL錐形瓶。(4)PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯2009，蔗糖209，蒸餾水1000mL，pH值自然。收稿日期：2012—0228基金項目：武漢市科技攻關計劃(200960223065)；湖北省教育廳科學技術研究項目(B20ll1701)作者簡介：金偉(1983)，男，安徽淮南人，碩士研究生，主要從事資

12、源與環(huán)境微生物研究工作；繆禮鴻，教授，通訊作者。萬方數(shù)據(jù)研究報告中國釀造2012鼉莖翌幫6期6322E4菌株的分類鑒定結果由圖l可知，菌絲分支分隔，分生孢子梗較短。項端膨大呈圓形的頂囊，上著許多單層或雙層的小梗，小梗單層，小梗著生分生孢子，孢子呈鏈狀，末端著生分生孢子。從鏡檢結果可以初步得出E4菌株為曲霉屬。圖1E4菌株鏡檢形態(tài)圖(1040倍)Figu怕1MorphoIogicalcha陷ctenslicsofE4(10x40)為了進一

13、步確定該菌的分類地位，在形態(tài)學的基礎上又進行了分子生物學鑒定。用通用引物擴增，將E4菌株測序得到的18SrDINA序列1080個堿基對在NCBI網頁上進行BLAST比對，選取同源性較高的模式菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結果表明E4的18SrDNA序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中AsJ崩鯽地缸n婦fUsSL30的同源性達100％(圖2)。因此，根據(jù)E4菌株的形態(tài)特征和18SrD咐A序列對比結果，可將E4菌株鑒定為一種煙曲霉。廠——————————

14、———LAfi肋蜘fIJsATccl022loo廣A^lm垃an_ISJ8M50r———————一E4?！猼————一A脅瞎枷ssL30O030O02500200015O0100005OOoo圖2菌株E4與相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure2PhyIogenet沁tn∞ofE4鍆d怕lat‘泔C婦dDsp咖』msp23碳源對菌株E4產酶的影響稻草CMC—Na棉￥T殼濾紙缺皮小同種類碳游圖3不同碳源對菌株E4產酶的影響Fgure3

15、EtfectofcarbonsourcesonceuIoseenzymeactiV時以4％不同的碳源進行50℃、17蛐發(fā)酵實驗，培養(yǎng)2d后測定CMCase酶活和濾紙酶活(圖3)。圖3表明，在不同種類的碳源培養(yǎng)基中，產酶能力有很大差別，與其他幾種原料相比，稻草產酶高出2倍?，F(xiàn)將E4菌株在50℃、170r，min搖瓶發(fā)酵產酶實驗，培養(yǎng)2d后測定CMCase酶活和濾紙酶活，結果見圖4。有文獻【切報道，稻草與麩皮混合作碳源能提高酶的產量，但從本

16、實驗結果來看純稻草作為培養(yǎng)基的纖維素酶活最高。謄舢羝勰4O：0040lO3O：l0202Ol030OO：40稻草比麩皮圖4稻草與麩皮不同配比對產酶的影響Figure4E竹ectOfratiOsOfstrawandbranOnceu10seenzymeactivity24起始口H值對菌株E4產酶的影響考察起始pH值對菌株產酶的影響，結果見圖5。菌株E4在初始pH值為45時濾紙酶活和CMC酶活達到最大?？偟膩碚f，在微酸條件下該菌能充分生長并

17、分泌纖維素酶，在pH值為50的條件下產酶活性最高，濾紙酶活達到356U／Ⅱ兒CMC酶活達到335U／腳【L。CMC酶活濾紙酶活圖5起始pH值對菌株E4產酶的影響Figure5EffectOfinitiaIpHVaIue0ntheenzymeprOductiOn25培養(yǎng)溫度對菌株E4CMC酶活和FPA活的影響以稻草作為發(fā)酵培養(yǎng)基，選擇不同溫度進行搖瓶發(fā)酵試驗，培養(yǎng)2d后測定纖維素酶活，結果見圖6。由圖6可以看出，菌株E4生長溫度比較寬，對